Die Arbeit im Labor
Nach langen Recherchen und spannenden Diskussionen machten wir uns im November endlich auf den Weg ins Labor. Eine Woche lang arbeiteten wir an dem hoch gesetzten Ziel, angelehnt an die Forschungen von Yoshida u. Yamasaki* aus dem Jahre 1959, eine synthetische Amylase unter Verwendung von zwei nicht-kanonsichen Aminosäuren (Ethionin und Norleucin) zu produzieren. In Bezug auf die Aminosäure Norleucin betraten wir mit unserem Ansatz Neuland. Das Know-How und tatkräftige Unterstützung bekamen wir von zwei WissenschaftlerInnen des Max-Planck-Institutes für Biochemie in Martinsried: Dr. Birgit Wiltschi und Mag. Michael Hösl.
Das verwendete Laborbakterium Bacillus subtilis** Stamm 1A55 , bezogen vom Bacillus Genetic Stock Center (http://www.bgsc.org/), sollte dabei Ethionin und/oder Norleucin in seinem Stoffwechsel miteinbeziehen und schließlich ein synthetisches Enzym ins Nährmedium segregieren.
Der von uns verwendete Bacillus subtilis-Stamm war Methionin-, Tryptophan-, Tyrosin- und Phenylalanin-auxotroph und konnte somit außerhalb des künstlich hergestellten Nährmediums nicht überleben.
Die Methionauxotrophie wollten wir nutzen. Wir mischten sechs verschiedene Nährmedien: Drei auf Basis des Bakterium-Standardmediums, genannt LB, und drei auf Basis eines anderen Standardmediums, genannt M9.
Bei LBM mischten wir Methion als natürliche Aminosäure bei, bei LBN ersetzen wir Methionin durch Norleucin, bei LBE durch
Ethionin. Nach dem gleichem Schema stellten wir M9M, M9N, M9E her. LBM und M9M (mit der natürlichen Aminosäurenzusammensetzung) sollten unsere Referenzproben sein, ob unser Bacillus-Stamm überhaupt Amylasen erzeugen würde, die sogenannten Nullproben. Die Mischrezepte finden sich im Laborprotokoll.
Zuerst mussten die vorhandenen Bakterien auf eine für die geplanten Versuche ausreichende Menge vermehrt werden. Dazu mischten wir unter sterilen Bedingungen die Vorkultur mit einem zuvor vorbereiteten Medium in einem Schikanenkolben, der dann in einem Schüttelinkubator mit der Idealtemperatur des Bakteriums, 37°C, gegeben wurde. Durch regelmäßige Photometermessungen wurde das Wachstum beobachtet. So konnten wir feststellen, wann das Bakterium seine Vermehrung beendet hatte. Bei jeder Messung wurde auch eine Probe für spätere Amylaseaktivitätstests abpippetiert und eingekühlt.
Die „ausgewachsene“ Hauptkultur wurde zentrifugiert, der dabei entstehende Zellüberstand abgeleert und filtriert. Das Filtrat versetzten wir mit Ammoniumsulfat, um das Ausfallen der Amylase herbeizuführen. Dieser Vorgang wurde wiederholt. Mit Hilfe eines Dialyseschlauches trennten wir das zuvor zugegebene Ammoniumsulfat von der Amylase.
Die Aktivität der Amylase der im Laufe der Woche genommenen Proben wurde mittels Photometermessungen bestimmt. Die Probe mit der Amylase versetzten wir mit Stärke und dieses Gemisch ließen wir auf einem Thermoblock für 30 Minuten bei 37°C inkubieren, wo die vorhandene Amylase die Stärke zu Zucker abbaute. Nach dieser Inkubationszeit gaben wir ein Iodreagenz hinzu. Das Iod lagerte sich in die noch nicht abgebauten Stärkekomplexe ein und färbte damit die Lösung
dementsprechend dunkel. Der Grad der Lichtdurchlässigkeit und der damit verbundene Abbaugrad konnten mit Hilfe eines Photometers gemessen werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Abschätzung der Amylaseaktivität eröffnet sich mit einer Stärkeagaroseplatte. Die amylasehältige Probe pippetierten wir auf eine solche Platte und die darin enthaltene Stärke wurde zersetzt. Dies konnte nach einigen Stunden durch die Zugabe von Iod sichtbar gemacht werden. Bereiche, in denen die Amylase die Stärke zu Glucose umwandelte, verfärbten sich nicht. Je mehr Fläche also ungefärbt blieb, desto aktiver war unser Enzym.
*Yoshida A. und Yamasaki M.: Studies on the Mechanism of Protein Synthesis into α –Amylase of Bacillus Subtilis, Biochimica et Biophysica Acta 1959, 34, 158-165
*Yoshida A.: Studies on the Mechanism of Protein Synthesis; Incorporation of p-Fluiorophenylalanine into α –Amylase of Bacillus subtilis, Biochimica et Biophysica Acta 1959, 41, 98-103
*Yoshida A.: Studies on the Mechanism of Protein Synthesis: bacterial α–Amylase containing ethionine, Biochimica et Biophysica Acta 1958, 29, 213-214
** http://microbio1.biologie.uni-greifswald.de:8080/institute/85