Überprüfung der Funktionalität der synthetischen Amylase durch Photometermessungen

Um die Amylaseaktivität unserer Proben zu bestimmen benötigten wir eine Methode, die schnell und einfach durchzuführen war. Wir kamen auf die Messung mittels Photometer, mit der zügig eine große Menge an Proben analysiert werden konnte.

Der Ablauf funktioniert folgendermaßen:

Man pipettiert 200 µl des vorbereiteten TRIS-Puffers in ein Eppi. Hinzu gibt man 50 µl der zu messenden Flüssigkeit. Für die nötige Blindprobe werden nur 250 µl Puffer genommen. In alle Eppis gibt man 1 ml Stärkelösung, welche zuvor hergestellt werden muss. Anschließend gibt man alle Reaktionen für 30 min bei 37 °C in den Heizblock. In dieser Zeit zerlegt die Amylase - falls vorhanden und aktiv - die enthaltene Stärke zu Glukose.

Nach diesem Vorgang werden 500 µl einer Iodlösung dazugegeben und mit dem Vortexer gut eingemischt. Das Iod lagert sich an die noch enthaltenen Stärkekomplexe an und färbt diese violett. Bei höherer Amylaseaktivität (und damit höherer Menge an abgebauter Stärke) wird die Probe nun nicht so stark verfärbt. Das heißt: je aktiver die enthaltene Amylase, desto heller die Lösung. Die Helligkeit, genauer gesagt: die Lichtdurchlässigkeit der Probe, kann mit dem Photometer bestimmt werden. Die Lichtdurchlässigkeit erhöht sich, wenn Stärke abgebaut wird.

Je nachdem, wo man den Nullpunkt setzt, sind die Ergebnisse positive oder negative Werte. Interessant ist aber einfach der Betrag vom Zahlenwert.

Es ist klar, dass mit dieser Methode keine Angaben in absoluten Zahlen über die Amylaseaktivität gemacht werden können. Jedoch ist eindeutig feststellbar, ob das Enzym arbeitet oder nicht. Zusätzlich lässt sich ein Trend feststellen, ob die Probe besonders aktiv ist.

Abbildung 1 (Tabelle 1): In dieser Grafik sieht man die verschiedenen Aktivitäten des Dialysates, d.h. des Ergebnisses der Proteinaufreinigung, bei verschiedenen Konzentrationen und Temperaturen. Je höher die Konzentration der Probe, desto höher ist die Aktivität der Amylase, und je wärmer die Probe, desto aktiver ist sie. Es handelt sich um einen eindeutigen Beweis dafür, dass unsere synthetische Amylase arbeitet.

Abbildung 2 (Tabelle 2): Man sieht, wie sich die Amylaseaktiviät bei laufender Entwicklung der Hauptkultur, der laufenden Vermehrung des Bazillius s., erhöht. Der Nullpunkt war die Jodlösung in der Nullprobe, die Trübung nimmt also mit der Aktivität der Amylase ab, weil mit ihr Stärke abgebaut wird und sich Jod nicht mehr an das Abbauprodukt Glucose anlagern kann. Der mathematische Betrag der Messwerte zeigt die Aktivität.

Abbildung 3 (Tabelle 3): Diese Darstellung vergleicht die

Amylaseaktivität in den verschiedenen Nährmedien (vgl. Laborprotokoll) für den Bazillus s. bei 37° und 70°C. Es ist deutlich erkennbar, dass die Aktivität bei 70°C um einiges höher ist, aber auch, dass in allen Nährmedien eine funktionstüchtige Amylase produziert wurde.

Man beachte: die Proben mit den synthetischen Aminosäuren Ethionin (LBE, M9E) und Norleucin (LBN) zeigen höhere Aktivität als die Referenzproben mit dem natürlichen Methion (LBM, M9M).

Dies könnte nun durch eine funktionstüchtigere synthetische Amylase oder auch durch eine höhere Konzentration der synthetischen Amylase in den Proben erklärt werden. Hierüber gibt diese Messmethode keinen genaueren Aufschluss. Da aber bei allen Proben die selben Ausgangskonzentrationen von Bakterien und Medien angesetzt bzw. alle Kulturen parallel gleich behandelt wurden sowie die selben Probenmengen entnommen wurden, ist eine höhere Funktionalität der synthetischen Amylase anzunehmen.

Diese Messungen deuten also darauf hin, dass die Amylase 2.0 aktiver ist als die natürliche: Amylase 2.0 dürfte besser arbeiten.