Abbildung 3. Zweistufige Ammoniumsulfatfällung der Katalase. S (Standard): Fermentas Prestained protein marker (#Sm0671), Auftragsmenge: 5µl; M9E: Bacillus subtilis Kultur, Medium: Minimalmedium M9, Zugegebene Aminosäure: Ethionin; LBE: Bacillus subtilis Kultur, Medium: Vollmedium LB, Zugegebene Aminosäure: Ethionin; Ü1: Überstand der Kultur; P1: Präzipitat bei Ammoniumsulfatzugabe zu 50 %; P2: Präzipitat bei Ammoniumsulfatzugabe zu 80 %; D1: Dialysat von Präzipität P1; D2: Dialysat von Präzipität P2. Es wurden jeweils 20 µl Kulturüberstand auf das Gel aufgetragen (+ 5µl 5 x SDS Auftragspuffer). In einer ersten Stufe wurden die Überstände (siehe Abbildung 3, Ü1) zu einer Endkonzentration von 50% mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Präzipitat (P1, siehe Abbildung 3) wurde durch Filtration abgetrennt. Zum erhaltenen zweiten Überstand wurde weiteres Ammoniumsulfat zu einer Endkonzentration von 80% zugegeben. Das Präzipitat (P2, siehe Abbildung 3) wurde durch Filtration abgetrennt. P1 und P2 wurden anschließend in 10 ml Trispuffer resuspendiert und über Nacht bei 4°C gegen Trispuffer dialysiert (Dialysate D1 und D2, siehe Abbildung 3). Abbildung 3 zeigt die Aufreinigung exemplarisch für die Kulturüberstände M9E und LBE.
Durch den ersten Schritt der Ammoniumsulfatfällung (Präzipitate P1) konnten kontaminierende Proteine aus der Probe entfernt werden. Vor allem das im Überstand (Ü1) am stärksten auftretende Protein bei ca. 37 kDa konnte fast gänzlich entfernt werden (siehe schwarze Pfeile in Abbildung 3).
Die Katalase konnte durch die weitere Zugabe von Ammoniumsulfat aus dem Kulturüberstand ausgefällt werden (siehe rote Pfeile in Abbildung 3). Durch die anschließende Dialyse wurde die Katalase wieder in Lösung gebracht (siehe Dialysate D2 in Abbildung 3).
Vergleicht man das Verhältnis von Katalase zu Gesamtprotein in Ü1 und D2 lässt sich feststellen, dass die Katalase durch die zweistufige Ammoniumsulfatfällung gegenüber den anderen Proteinen im Kulturüberstand stark aufkonzentriert wurde.

Die Dialysate D2 wurden in der Folge für weitere Analysen herangezogen. Aus Zeitgründen konnte bis zur Fertigstellung dieses Berichts nur die massenspektrometrische Analyse der Proben LBE durchgeführt werden.