Die Arbeit im Labor - Katalase aus Bacillus subtilis
Das Ziel unserer Laborarbeit war die Expression von Katalase in Gegenwart der nicht-natürlichen Aminosäuren Ethion und Norleucin. Das verwendete Laborbakterium (Bacillus subtilis Stamm 1A55, bezogen vom Bacillus Genetic Stock Center, http://www.bgsc.org/) sollte die nicht-kanonischen Aminosäuren in seinen Stoffwechsel miteinbeziehen und schließlich ein synthetisches Enzym ins Nährmedium abgeben. Der von uns verwendete Bacillus subtilis-Stamm war Methionin-, Tryptophan-, Tyrosin- und Phenylalanin-auxotroph und konnte somit außerhalb des künstlich hergestellten Nährmediums nicht überleben.
Die Methionauxotrophie des ausgewählten Bakterienstammes wollten wir nutzen.
Wir mischten sechs verschiedene Nährmedien. Drei auf Basis des Bakterium-Standardmedium, genannt LB,
und drei auf ein anderes Standardmedium, genannt M9. Bei LBM mischten wir Methion als natürliche Aminosäure bei, bei
LBN ersetzen wir Methionin mit Norleucin, bei LBE mit Ethionin. Nach dem
gleichem Schema stellten wir M9M, M9N, M9E her.Jeweils
LBM und M9M mit dem der natürlichen Aminosäurenzusammensetzung sollten unsere Referenzproben sein, ob unsere Bacillusstamm
überhaupt Amylasen erzeugt, also die sogenannte Nullprobe.
Die Mischrezepte finden Sie in Tabelle 1.
Obwohl unser Bacillus Stamm sicher war, wurden alle Maßnahmen zur Vermeidung einer Kontamination der Außenwelt sehr gewissenhaft und genau ausgeführt: Alle bei den Arbeiten verwendeten Einmalgerätschaften wurden im Autoklaven oder Certoklaven inaktiviert und anschließend weggeworfen. Lösungen mit speziellen Färbemittel wurden einer Sondermüllentsorgung zugeführt. Ebenfalls wurden alle Organismen durch Hitzesterilisation inaktiviert. Die Laborgeräte, Arbeitsbereiche, Labortische etc. wurden mit Desinfektionslösung gereinigt bzw. die Reinraumbank zusätzlich nach der Reinigung und Desinfektion mit UV-Licht behandelt.
Anlegen der Vorkultur
20 µl des auf Trockeneis gelagerten Glycerin-Stocks des Bacillus subtilis-Stammes 1A55 werden zum Anlegen einer Vorkultur verwendet. Dazu werden 10ml des LB Mediums (fertig gemischt kommerziell erhältlich) unter der Reinraumbank in ein steriles 50ml Falconröhrchen gefüllt. Danach wird das Medium mit dem Glycerin-Stock mittels einer Pipette beimpft.
Es ist auf absolute Sterilität zu achten. Jedes verwendete Gerät ist entweder abzuflammen, mit UV-Licht
zu behandeln oder mit 70%-Ethanol abzuwischen. Auch sind Handschuhe zu tragen, die ebenfalls desinfiziert werden sollten.
Die beimpften Medien werden über Nacht bei 37°C in den Schüttelinkubator gestellt. Die Röhrchen sind leicht schräg
zu platzieren, damit eine gute Durchmischung mit Luft gewährleistet ist. Der Deckel wird nur soweit festgeschraubt, dass er gerade
noch sicher hält. Auf diese Weise kann die Luft außerhalb und innerhalb es Röhrchens zirkulieren.
Bestimmen der optischen Dichte
Um die optische Dichte der Probe - und damit die Menge der darin enthaltenen Keime - feststellen zu können, werden unter sterilen Bedingungen 0,9ml keimfreien Nährmediums in eine Küvette überführt. Dazu kommen 0,1ml des beimpften und bebrüteten Nährmediums, das zuvor gut gevortext/durchmischt werden muss. Mit Hilfe eines Photometers wird bei 550nm Absorption die optische Dichte bestimmt. Als Blindprobe dient 1ml LB-Medium. Auch hier sollte auf steriles Arbeiten geachtet werden, damit keine Fremdkeime in die Vorkultur gelangen. Bei der Küvette muss man nicht mehr auf eine sterile Arbeitsweise achten - sie wird ohnehin entsorgt.
Ansetzen der Hauptkultur
Zunächst muss das Volumen für das Inokulum für die Hauptkultur berechnet werden. Dabei sollte die optische Dichte der Hauptkultur 0,1 betragen.
VInokulum = (VHK*Start OD550) / OD550VK
Unter sterilen Bedingungen wird das Nährmedium (100ml LB, 200ml M9) in die autoklavierten Schikanenkolben gefüllt. Danach wird das berechnete Inokolum aus der Vorkultur in den Schikanenkolben pipettiert. Dabei ist wieder auf absolut sauberes Arbeiten zu achten und der Schikanenkolben außerhalb der Reinraumbank immer mit Alufolie abzudecken. Die Ränder und Deckel sämtlicher Gefäße müssen nach jedem Öffnen und vor jedem Schließen abgeflammt werden.
Der Schikanenkolben mit dem nun beimpften Nährmedium wird bei 37°C in den Schüttelinkubator gestellt. Dabei ist die
Drehzahl so zu wählen, dass das Medium gut schäumt und somit viel Sauerstoff zu der Kultur gelangt.
Nach 1h, 3h, 5h, 7h, 20h, 22h, und 24h wird jeweils 1ml der Zellsuspension unter sterilen Arbeitsbedingungen in eine Küvette überführt
und die optische Dichte (und damit das Zellwachstum) bestimmt. Optische Dichte und Zeit sind wichtige Faktoren für die Erstellung einer Wachstumskurve.
Die Proben werden anschließend in der Epifuge bei maximaler Geschwindigkeit 2 Minuten abzentrifugiert und die Zellüberstände mit einer
Pipette in ein Eppendorfergefäß überführt, worin sie gekühlt gelagert werden.
Zellernte und Gewinnung der Katalase
Sobald die optische Dichte abzufallen beginnt hat das Sterben der Zellen begonnen. Es ist rasch zu handeln, weil nun Proteasen (= Enzyme, die
fähig sind, Enzyme abzubauen) in das Medium gelangen, die das gesuchte Enzym Katalase zerstören können. Die Zellsuspension wird,
nun nicht mehr steril, in 50ml Falconröhrchen aufgeteilt und in der Zentrifuge bei 3500rpm 10 Minuten abzentrifugiert. Der Zellüberstand
wird nun - ohne das Zellpellet aufzuwirbeln - in einen Faltenfilter abdekandiert. Der auf diese Weise gewonnene Zellüberstand enthält
sämtliche in den Bakterien expressionierten Proteine.
Das Filtrat versetzten wir mit Ammoniumsulfat, um das Ausfallen der Katalase herbeizuführen. Diese Flüssigkeit wurde noch insgesamt zweimal gefiltert.
Mithilfe eines Dialyseschlauches trennten wir das zuvor zugegebene Ammoniumsulfat von der Katalase. Mit einem SDS-Gel trennten wir alle Proteine in
unserem Substrat auf und kühlten es für die spätere Analyse in der Massenspektrometrie am Max-Planck-Institut ein.
Tabelle 1: Medien
LB Medium
0.5% (w/v) yeast extract |
5 g/l |
1% (w/v) Bacto tryptone |
10 g/l |
1% (w/v) NaCl |
10 g/l |
LB+ Medium
0.1% (w/v) glucose |
1 g/l |
L-Phenylalanin |
50 mg/l |
L-Tyrosin |
50 mg/l |
L-Tryptophan |
50 mg/l |
0.5% (w/v) yeast extract |
5 g/l |
1% (w/v) Bacto tryptone |
10 g/l |
1% (w/v) NaCl |
10 g/l |
LBM Medium
LB+ Medium |
100 ml |
L-Methionin |
50 mg/l |
Methionin in LB+ Medium auflösen und sterilfiltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
LBE Medium
LB+ Medium |
100 ml |
L-Ethionin |
10 g/l |
Ethionin in LB+ Medium auflösen und sterilfiltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen;kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
LBN Medium
LB+ Medium |
100 ml |
L-Norleucin |
10 g/l |
Norleucin in LB+ Medium auflösen und sterilfiltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
5x M9 Konzentrat
Na2HPO4·2 H2O |
42.5 g/l |
KH2PO4 |
15 g/l |
NH4Cl |
5 g/l |
NaCl |
2,5 g/l |
pH Wert mit NaOH auf 7.0 einstellen; autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern.
100x Spurenelementelösung
MnCl2·4 H2O |
100 mg/l |
ZnCl2 |
170 mg/l |
CuCl2·2 H2O |
43 mg/l |
CoCl2·6 H2O |
60 mg/l |
Na2MoO4·2 H2O |
60 mg/l |
Sterilfiltrieren und lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern.
100 mM CaCl2
CaCl2·2 H2O |
1.47 g / 100 ml |
Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern.
1M MgSO4
MgSO4·7H2O |
24.6 g / 100 ml |
Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern.
50 mM FeCl3
FeCl3·6H2O |
1.35 g / 100 ml |
Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern.
M9 Medium
5x M9 Konzentrat |
200 ml/l |
100x Spurenelementelösung |
10 ml/l |
100 mM CaCl2 |
1 ml/l |
1 M MgSO4 |
1 ml/l |
50 mM FeCl3·6H2O |
1 ml/l |
L-Phenylalanin |
50 mg/l |
L-Tyrosin |
50 mg/l |
L-Tryptophan |
50 mg/l |
Glucose |
5 g/l |
Mit destilliertem H2O auf 1 L auffüllen, Glucose und Aminosäuren auflösen, sterilfiltrieren und bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
M9M Medium
M9 Medium |
200 ml |
L-Methionin |
50 mg/l |
Methionin in M9 Medium auflösen und sterilfiltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
M9E Medium
M9 Medium |
200 ml |
L-Ethionin |
50 mg/l |
Ethionin in M9 Medium auflösen und sterilfiltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4°C gelagert werden.
M9N Medium
M9 Medium |
200 ml |
L-Norleucin |
50 mg/l |
Norleucin in M9 Medium auflösen und sterilfiltrieren; 2 ml in ein steriles 2 ml Eppi aliquotieren („Blank“) & bei 4 °C lagern; bald verbrauchen; kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.