Vermehrung der selektierten Cyanobakterien (Blaualgen) zu einem attraktiven Stickstoff-Dünger (Bio-Verfahrenstechnologie der HTL-Braunau):

1 Allgemeines:
Um Mikroorganismen zum Zwecke der Gewinnung von wirtschaftlich interessanten Produkten (Bier, Citronensäure, Ethanol, Penicillin,…) zu vermehren, gibt es bereits eine Reihe von Verfahren der Biotechnologie, bei denen man Bioreaktoren einsetzt. Bioreaktoren werden in drei Kategorien eingeteilt, in Batch-, Fed Batch- und kontinuierlichen Prozess. Der prinzipielle Unterschied zwischen Batch- und kontinuierlichem Prozess besteht darin, dass bei einem Batch- Prozess die Anlage in regelmäßigen Abständen befüllt und entleert wird. Die Zeit, wie lange der Prozess läuft, ist abhängig von der Synthesereaktion oder der gewünschten Menge an Biomasse. Der Reaktor wird vollkommen entleert und einem Substrat- und Organismen-Tausch unterzogen. In einem kontinuierlichen Prozess hingegen wird dem Bioreaktor stetig Substrat zugeführt und Biomasse abgepumpt. Bioreaktoren müssen fast immer steril betrieben werden, das heißt , man darf keine Fremdorganismen einschleppen, die zu Fehlprodukten führen können. Bei einem Batch- Reaktor ist dies nicht so schwierig, bei jedem Tausch des Mediums wird der Reaktor neu sterilisiert. Bei einem kontinuierlichen Prozess, der theoretisch „ewig“ läuft, ist die Einhaltung steriler Bedingungen besonders wichtig.

2 Projektziel:
Ziel war es, eine Anlage zu planen und auch aufzubauen, die kontinuierlich Biodünger aus Blaualgen herstellt. Aus einem Prototyp sollte dann eine wirtschaftlich rentable Großanlage konstruiert und gebaut werden. In unserer Vorrichtung sollen sich die von der HBLA Ursprung nach intensiver Forschungsarbeit selektierten und vor getesteten, ungiftigen Stämme der Cyanobakterien vermehren und dabei möglichst viel Stickstoff aus der Luft aufnehmen, der dann in der Biomasse als Protein oder Protein-Vorstufe gebunden wäre. Es soll somit eine preisgünstige und umweltfreundliche Methode zur Synthese von biologischem Stickstoff-Dünger entwickelt werden. Herkömmliche N-Kunstdünger werden über die Ammoniak-Schiene ja sehr kostenintensiv und nicht umweltfreundlich produziert, enthalten teilweise zu leicht verfügbaren Stickstoff in Form von Ammonium- und Nitrat-Ionen, womit auch zusätzlich Probleme für das Grundwasser gegeben sind.

3. Welche „Ressourcen“ benötigt man?
3.1 Substrate:
Als mineralisches „Futter“ für unsere Cyanobakterien ( Blaualgen) verwenden wir eine Ionenkombination mit Haupt- und Spurensoffen, die sich im Institut für Limnologie (Gmunden) als sehr erfolgversprechend erwiesen hat. (Zusammensetzung: siehe Anhang) In geeigneten Schraubverschlussflaschen wurde das Substrat eingebracht und mit unserem Dampfsterilisator (Certoclav) bei 124°C für 40 Minuten sterilisiert und so steril wie möglich mittels HCl (c= 0,1mol/L) und pH-Elektrode auf pH= 7,2 gebracht..

3.2 Steril-Luft:
Die benötigte Stickstoffmenge wird als Luft mittels einer Großaquarienpumpe durch einen selbstgebauten Vorfilter über einen Schwebkörperdurchflussmesser in den Sterilisationsfilter eingedrückt, von wo das Gas mittels ein Horizontalrohr in das „Air-Lift-System“ eingedüst wird. Auf diese Weise wird einerseits eine Stickstoffanreicherung des Substrates und andererseits ein pumpenartiger Auftrieb in unserem selbst entworfenen Vertikalrohr-Pumpen-Systemes erreicht. Hier stellen sich auch für die einzelnen Gaskomponenten der Luft im flüssigen Medium individuelle, d. h. gasspezifische Gleichgewichtszustände ein. Es dürfte sich nach kurzer Zeit ein Massenverhältnis von N ₂ : O₂ : CO>₂: = 1: 2: 80 (Druck 1bar, Temperatur 20°C) eingestellt haben. Zusammensetzung von Luft: 78 % Stickstoff, 21% Sauerstoff, 1% Edelgase und 0,03% Kohlendioxid. Unsere Bakterien benötigen für das Wachstum im Rahmen der Photosynthese Kohlendioxid, das auf Grund der guten Wasserlöslichkeit von CO₂ im Substrat (Chemisorption) angereichert wird. Ebenfalls gelöst wird etwas Stickstoff, der für unseren Prozess ja essentiell ist, sowie natürlich auch der Sauerstoff. In welchem Verhältnis die Luftkomponenten im Substrat dann tatsächlich vorliegen, konnte aus der Literatur noch nicht recherchiert werden, wird aber die Untersuchungsaufgabe der nächsten Zeit sein.

Ein kleiner Stickstoffsteckbrief:
Stickstoff ist ein farbloses, geruchloses und chemisch reaktionsträges Gas. Das Molekül ist relativ klein und weist eine Dreifachbindung auf. Elektronegativität: 3,04 (Pauling). Mit Wasser dürften sich kaum Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden, worauf die geringe Löslichkeit zurückzuführen ist.

Vereinfachtes Reaktionsschema für die Chemisorption von Stickstoff durch das Bakterium:
Über einen sehr komplexen photoneniduzierten Prozess kann mittels des Enzyms „Nitrogenease“ das Cyanobakterium den gelösten Stickstoff aus dem Substrat aufnehmen und über eine REDOX-Reaktion an organische Materie verknüpfen. Ob der für die Bildung von Glutamin notwendige Kohlenstoff ebenfalls über die Heterocysten oder die anderen Verbandszellen erfolgt, ist noch nicht eindeutig geklärt. Die Stickstoffbindung spielt dabei wahrscheinlich eine wichtige Rolle für den Auf- bzw. Abbau von Proteinen für die eigenen und die Verbandszellen.

3.3 Lichtquellen:
Da für den Vermehrungsprozess unserer „Photobakterien“ elektromagnetische Energie notwendig ist, verwenden wir für die kontinuierliche Laborreaktoranlage eine konstante Lichtquelle, die wir auch Tag und Nacht einsetzen können. Wir simulieren quasi die Sonne, um möglichst schnell an optimierten Testergebnissen zu kommen. Für unsere Anlage verwenden wir derzeit dieselben Leuchtstoff-Röhren, die auch die Partnerschule für ihre Testserien angewendet hat, nämlich Typen der Fa. Osram mit einer Farbnummer von „965“ (sonnennahe Spektralverteilung). Wir arbeiten derzeit im Röhrenreaktor mit einer Strahlungsleistung von 10-20 W/m² (diese erhalten wir in einem Abstand von 25-30mm von der Röhrenoberfläche) Bei der schon in der Erstentwicklung befindlichen Großanlage soll im Sommerbetrieb ausschließlich die Sonne genützt werden, die auch gleichzeitig die notwendige Wärme zwischen 20-30 °C liefern soll. Für den Winterbetrieb verwenden wir wahrscheinlich denselben Lampentyp, der in einer Leuchtflächenanordnung mit geeigneten Reflektoren sowohl elektromagnetische Energie als auch die Wärme liefern kann. Das natürlich nur dann, wenn diese Methode sich als wirtschaftlich erweist. Das hängt davon ab, ob wir die Vermehrungsraten der Cyanobakterien deutlich steigern können. Unser kontinuierlicher Sandwich-Stickstoff-Kollektor, der für den Winterbetrieb optimal isoliert wird, sollte dann relativ energiesparend Stickstoffdünger produzieren können. Die dazu notwendige elektrische Energie sollte über moderne Photovoltaiktechologie erhalten werden.

3.4 Reaktorwärme:
Beim vertikal angeordneten Röhrenreaktor zieht die von der Lichtquelle mäßig produzierte Abfall-Wärme aufgrund des Kamineffekts von unten nach oben, wobei wir durch geeignete Belüftungsöffnungen den Vertikalluftstrom so steuern können, dass die optimalen Temperaturen für die Zellteilungen zwischen 20-30°C liegen können. Beim Großreaktor, der am Glashaus oder auf Dächern positioniert wird, erwärmt die Sonne direkt die hier verwendeten Glasröhren, welche wiederum über ein einfaches Lüftungssystem von unten gut thermostatisierbar sein sollte. Wichtig ist, dass in keinem Fall die Temperatur über 30° steigen darf, da sonst die Zellen geschädigt würden.

4 Entwicklung unserer Anlage:
Nach vielen Diskussionen und nach Rücksprache mit dem Partnerteam, sind wir zum Schluss gekommen, dass die Labortestanlage als „Röhrenreaktor“ unter Verwendung von billigen , aber „lebensmittelechten“ PVC-Schläuchen und die für die Praxis gedachte Großanlage aus gut lichtdurchlässigen Glasröhren als jeweiliges Herzstück, gefertigt werden sollten.

4.1 Arbeitsprinzip des Röhrenreaktors:
Neben dem Röhrenreaktor als eigentliche Vermehrungsstation ist eine zentrale Frage die schonende Förderung von Cyanobakterien-Suspensionen, da alle üblichen Pumpen die Zellverbände zerstört. Als Neuerung wurde –durch Vorexperimente unterstützt- ein Glasrohr-Pumpensystem entwickelt und vom Glasbläser nach unseren Plänen gefertigt. Es funktioniert nach dem bereits beschriebenen Verfahren des Air-Lift-Systems, bei dem man durch Einblasen von Luft (Gasen) eine Dichtverringerung des flüssigen Mediums erreicht, das dadurch in der Steigröhre einen Auftrieb erhält. Durch den dadurch resultierenden Pumpeneffekt wird das lebende Suspensionsmedium von oben her durch den Röhrenreaktor gedrückt, in dem das Hauptwachstum der Cyanobakterien unter Licht- und Temperaturkontrolle stattfindet (Aktivierungseinheit). Unter Sterilität und in Abhängigkeit der Zeit, des pH-Wertes und der Suspensionsqualität vermehren sich nun die Stickstoffbinder und reichern sich im unteren Teil des integrierten Absetzers der Air-Lift-Anlage an (Sedimentationsanreicherung). Von dort wird das Stickstoffdüngerkonzentrat periodisch oder kontinuierlich mittels einer Schlauchpumpe abgezogen und im Düngervorratsbehälter gelagert. Den Flüssigkeitsverlust ersetzt man durch Einpumpen des Sterilsubstrats ebenfalls mittels einer Peristaltikpumpe. Die gesamte Anlage kann mittels einer einfachen SPS auch automatisiert werden.

4.2 Die Konstruktionen:
4.2.1 Der Röhrenreaktor, Prototyp 2:
Das Haltegerüst der Anlage besteht aus vier mittleren Gewindestangen (Durchm. 10mm) und aus sechs weiteren Gewindestangen etwas außerhalb, die auf einer stabilen Bodenplatte so justiert sind, dass der ausgewählte Kunststoffschlauch (Innendurchmesser 12mm) in gleichmäßigen Windungen zu einer Spirale geformt werden können. Drei Stabilisationsbleche mit Hohlräumen für den Lichtbalken und die Luftzirkulation zwischen den Stäben vervollständigten die „Spiralkonstruktion“..

Diese Konstruktion steht auf einem Unterbau mit zwei Flächen, der so gefertigt ist, dass sowohl die Platte mit den drei Regelhähnen als auch alle Schalter funktionsgerecht montiert werden können. Als Lichtquelle zentrierten wir in der Spiralenmitte eine Tageslichtlampe (Osram-965, 58W) die nicht nur die Lichtversorgung übernimmt, sondern auch als konstante Schwachwärmequelle funktioniert.

Zur Erreichung eines maximalen Lichtwirkungsgrades ist um die Schlauchwindungen ein zylindrischer Mantel aus Hochglanz-Aluminiumblech als Reflektor fixiert. In den Boden und die Grundplatten schnitten wir vier Löcher, die Frischluft zuführen, da die warme Luft aufgrund des Kamineffektes durch die Anordnung nach oben strömt. Diese Löcher sollen die Temperatur im Reaktor stabilisieren, um den Cyanobakterien optimale Temperaturbedingungen bieten zu können.

Der nächste wichtige Punkt war die Auswahl einer geeigneten Pumpe. Dafür führten wir eine Reihe von Pumpentest mit mehreren Pumpentypen (Kolbenpumpen, Membranpumpen, Schlauchpumpen) durch und kalibrierten ihre Pumpleistung in Abstimmung auf unsere Aufgaben.

Für die Zufuhr der Steril-Luft wurde eine große Aquarienpumpe installiert. In diesem Luftkreislauf befindet sich auch noch ein Vorfilter, ein Schwebkörperdurchflussmesser, ein Hauptsterilfilter (Porenweite 0,2µm), der Gasinjektor, das Substrat und ein Sterilfilter als „Wache“ beim Ausströmen der Überschussluft aus dem „Air-Lift-System“.

Für die Befüllung unseres Prototyps 2 benötigen wir ca. 3-4 Liter sterile Substratlösung. Zur manuellen Steuerung des Reaktors verwenden wir Dreiweghähne, die auf einem Steuerbord befestigt sind. Mit diesen Hähnen wird der Reaktorzu- und Abfluss sowie der Endproduktabfluss derzeit mechanisch geregelt. Weiters können Pumpe und Licht über Schalter betätigt werden, die unterhalb des Reaktors befestigt sind. Für die Substratzufuhr bzw. das Gewinnen des gewünschten Düngers werden Peristaltikpumpen (Schlauchpumpen), geeignete, sterilisierbare Behälter und das „Air-Lift-System“ verwendet.

Legende:
1 Subtrat
2 Sterilfilter klein
3 Substratpumpe (Kolben oder Schlauchpumpe
4 Stativstange
5 Hahn: Düngerentnahme
6 Substratzufuhr
7 Luftzufuhr
8 Schlauchpumpe: Düngerentnahme
9 Luftpumpe
10 Luftvorfilter
11 Schwebkörperluftmengenmesser
12 Hauptsterilfilter
13 Lichtreflektorzylinder
14 Leuchtstoffröhre
15 Röhrenreaktor
16 Sammler für Dünger
17 Sterilfilter klein
18 Steuerboard
19 Transporthähne
20 AIR LIFT Umwältzeinheit
21 Sterilluft Einlass
22 Luftauslass, Substratzuführung
23 Temperaturfühler
24 pH Sensor
25 Temperaturfühler
26 integrierter Absetzer für die Cyanobakterien

4.2.2 Der Sandwich-Stickstoff-Kollektor (SSK) für die Praxis:
Diese Anlage befindet sich derzeit in der Bauanfangsphase. Im Wesentlichen wird die Vorrichtung alle Komponenten wie die Laboranlage enthalten. Das eigentliche Herzstück, nämlich der sog. SSK (Sandwich-Stickstoff-Kollektor) wird aus Gründen der praxistauglichen Bauweise und Nutzung im Freien natürlich anders gestaltet werden müssen.

Sommerbetrieb:
Wie aus dem vereinfachten Konstruktionsschema zu erkennen ist, fließt das Substrat durch sonnenbeschienene Glasrohre, die über spezielle Kopplungsmechanismen zu gewünschten rechteckigen Einheiten verknüpft werden können. Nach diesem Prinzip können 10 – 20 Reaktionsrohre aus Glas (dzt. vorliegender Außendurchmesser 24mm, Länge 1500mm) modulartig parallel so zusammengekoppelt werden, dass sie- ähnlich einem üblichen Solarkollektor - (aber ohne Glasabdeckung) in einem Rahmenbehälter („Lade“) transportfähig gesichert werden können.

Durch entsprechende Orientierung der Rohre in der „Lade“ und der Lade gegenüber der Sonne kann die elektromagnetische Energieeinstrahlung der Sonne optimal für die Bakterienzucht genutzt werden. Um Überhitzung zu vermeiden ist die Lade von unten her durch geeignete Schiebefenster belüftet. Ebenso können entsprechende Aluminiumreflektoren um die Lade herum und unter den Rohren zur solaren Effektivitätssteigerung eingebaut werden.

Winterbetrieb:
Um die Vorrichtung auch im Winter betreiben zu können, wäre es vorgesehen, die SSK mit einer Beleuchtungseinheit, bestehend aus den Leuchtstoffröhren, so eng wie erforderlich gelegt („Beleuchtungskappe“), zu bedecken, indem man die gesamte Einheit („Lade“ und „Kappe“) derart thermisch isoliert, dass sowohl die Licht-Energie als auch die Wärmeabstrahlung der Lampe für den Vermehrungsprozess optimal und wirtschaftlich genutzt werden kann.

Legende:
1 Holzumkleidung
2 Alu-Winkel
3 Rohrstabilisator
4 Alu-Reflektor
5 Zulauf
6 Ablauf
7 Reaktorrohr
8 O-Ring-Kupplung
9 Belüftung
10 Haltegriff
11 Leuchtstoffröhre
12 Isolation
13 Glasrohr
14 Krümmer
15 O-Ring,Gummi
16 Stabilisierung

5. Sterilkammern:
Bei der Überimpfung, mikroskopischen Kontrollen und Züchtung von Mikroorganismen müssen hohe Sterilitätsanforderungen eingehalten werden. Diese Sterilität müssen wir aufrecht erhalten, um eine Verunreinigung von Anlagenteilen und dadurch ganzer Ansätze zu verhindern. Da wir keine Sterilbank an unserer Schule haben, funktionierten wir zwei Aquarien zu „Sterilboxen“ um, wobei wir uns ständig den Rat der Partnerschule einholten.

6 Inbetriebnahme der kontinuierlichen Labortestanlage („Röhrenreaktor“)
6.1 Sterilisierung der gesamten Testanlage:
Da die sich entwickelnden Cyanobakterien-Stämme nicht mit Fremdstämmen kontaminiert werden dürfen, müssen periodisch alle Anlagenteile mit Sterilisierlösugen (70% Ethanol oder andere „Bakterizide“) sterilisiert werden. Flaschen werden mit Dampfdruck oder im Trockenschrank sterilisiert.

6.2 Eigentlicher Betrieb der Testanlage
Nach Herstellung der sterilen Substratlösungen, die in 1-5 L Charchen bevorratet werden, wird die Anlage über eine Schlauchpumpe unter Einhalten von Sterilbedingungen gefüllt und anschließend je nach experimenteller Fragestellung mit verschieden großen Mengen unterschiedlicher Stämme beimpft. Durch Einleiten der variablen Volumsmenge an Sterilluft kann sowohl die Umpumpgeschwindigkeit über das Air-Lift-System als auch gleichzeitig das Angebot an Luftstickstoff (oder anderen Gasen) variiert werden. Zur Versorgung der Bakterien mit Lichtenergie und Wärme wird die im Röhrenreaktor zentrierte Leuchtstoffröhre eingeschaltet und die Messsensoren für Temperaturen und pH-Wert aktiviert. Alle Vermehrungsparameter können über die Konzentration, Qualität und die Zeit variiert und optimiert werden. Der im Air-Lift-System integrierte Absetzer konzentriert die Cyanobakterien über Gravitation auf. Von hier kann man über eine eigene Schlauchpumpe das Düngerkonzentrat in die Vorratsbehälter absaugen, während man die Substratlösung wieder ergänzt. Je nach Zielsetzung kann man die Anlage kontinuierlich oder im „Batch-Betrieb“ fahren. Aufgrund der langsamen Vermehrungsrate der Cyanobakterien dauert ein Volltest für bestimmte Stämme zwischen 4-6 Wochen.

Kontrolle des Canobakterienwachstums (Photometrie)
Filterphotometer: WTW PMP 3000, Analysenwaage (d= 0,1mg)
Zur laufenden Kontrolle des Wachstums der Kulturen entnehmen wir periodisch kleine Mengen aus dem Kreisstrom über einen Dreiweghahn und messen die Lichtdurchlässigkeit mit einem Photometer in einer gut geschüttelten, verschließbaren 10 mm Küvette bei einer Wellenlänge von 415nm, weil wir hier die höchste Empfindlichkeit erreicht haben. Unsere Extinktionswerte lagen dabei zwischen 0,1-1,4.
Aus einer Kalibrierkurve, die man aus der Bakterien (Algen)-trockenmasse und den dazugehörigen Extinktionswerten ermittelt, kann jeweils auch die Massenzunahme objektiv aus der Lichtabsorption ermittelt werden.

7. Zukunftsaspekte
Da die derzeitige Wachstumsgeschwindigkeit von Cyanobakterien mit einer Verdopplungsrate von ca. 24 Stunden relativ langsam ist, und auch die gewünschte Stickstoffaufnahme aus der Luft noch nicht den gewünschten Spitzenwert erreicht hat, (landwirtschaftliche Nutzung) müssen noch weitere forscherische Untersuchungen gemacht werden. Die einfachste Methode zur Stickstoff-Anreicherung wäre der Einsatz einer einfachen Zentrifugenstufe, bei der auch gleichzeitig der Zellverband so zerteilt wird, dass er möglichst düngewirksam ist. Weitere Maßnahmen:

a) Optimierung aller Parameter, die man bei unserem Röhrenreaktor-Prototypen variieren kann.
b) Einsatz von Reinstammmischungen. Eventuell gibt es gegenseitige positive Beeinflussungseffekte.
c) Vermehrung der stickstoffbindenden Heterocystenzahl pro Zellverband durch Behandlung der Stämme mit unterschiedlichen Mengen an Stickstoff, Kohlendioxid und Sauerstoff (Begasungsversuche)
d) Vermehrung der Heterocystenzahl bzw. der Leistungsfähigkeit des N-Bindevermögens durch vorsichtige Mutationsversuche mit UV-Licht, Temperaturschock, Peroxiden oder natürlicher γ-Strahlung, wie sie aus Kaliumsalzen frei wird.
e) Vermehrung von Heterocysten bzw. Zellverbänden durch gepulste elektrische Stimulation in Gleich- Wechselspannungsfeldern.

Quellen:
• www.kleinjakob.at/wp-content/uploads/2006/06/Kontinuierliche%20Fermentation.pdf
• http://www.wasser-wissen.de/abwasserlexikon/f/fermenter.htm
• www.mts-filtertechnik.de
• http://www.cryo-technik.de/sterilfilter.htm
• Cypionka Nerkbert: Grundlagen der Mikrobiologie, 2.Auflage Springer-Verlag 2002
• Hans G.Schlegel, Christiane Zaborosch: Allgemeine
Mikrobiologie, 7.Auflage 1992 Georg Thieme Verlag
• Roland Süßmuth, Jürgen Eberspächer, Rainer Haag Wolfgang Spinger: Mikrobiologische- Biochemisches Praktikum, 2 Auflage Springer Verlag 1987
• Hans G.Schlegel. Allgemeine Mikrobiologie, 3.Auflage Georg Thieme Verlag 1974