Eine Polymerase Kettenreaktion ist ein Verfahren, bei dem ein genau definierter Abschnitt eines DNA-Stranges vervielfältigt wird. Anhand von Skizzen wird dieser Vorgang nun genauer erklärt:

Diese Grafik soll einen DNA-Strang darstellen. Der Bereich innerhalb der beiden roten Linien ist der gesuchte Abschnitt und soll demnach vermehrt werden.

Um diesen Abschnitt vermehren zu können, muss nicht der ganze Bereich bekannt sein. Es reichen zwei kurze bekannte Teilstücke, die meistens zwischen 18 und 30 Nukleotide lang sind. Diese sind in der Skizze grün beziehungsweise blau eingezeichnet. Sobald man die genaue Abfolge der Basen dieser beiden Stücke kennt, müssen dazu komplementäre Gegenstücke hergestellt werden.

Diese Stücke werden Primer genannt. Stehen die Primer zur Verfügung, kann man mit der eigentlichen PCR beginnen.

Zunächst wird während der Denaturierungsphase die doppelsträngige DNA auf 96°C erhitzt. Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, aufgebrochen, damit sie nur mehr einzelsträngig vorliegen.

Für den zweiten Schritt, die Primerhybridisierung (auch Primer-Annealing genannt), wird die Temperatur auf ca. 50- 65°C gesenkt, damit die Primer an den richtigen Stellen anbinden können. Die ideale Annealingtemperatur ist von Primer zu Primer verschieden. Dies ist sowohl von der Länge der Primer als auch von der Anzahl der Basen Cytosin und Guanin abhängig. Zwischen diesen zwei Basen befinden sich stets drei Wasserstoffbrückenbindungen, die die Primer fester an den DNA-Strang binden. Somit wird eine höhere Schmelztemperatur benötigt.

Diese sollte jedoch so genau wie möglich gewählt werden, da sich die Primer bei zu hoher beziehungsweise zu niedriger Temperatur an falschen Stellen oder auch gar nicht binden könnten. Läuft alles richtig, kann man sich die Bindung wie in der folgenden Skizze vorstellen.

Für den nächsten Schritt wird die Temperatur auf 72°C erhöht, um dem Enzym Polymerase perfekte Arbeitsbedingungen zu schaffen. Dieses setzt an den Primern an und ergänzt den DNA- Strang komplementär dazu. Dazu verwendet man eine so genannte taqPolymerase. Sie wird aus dem Bakterium Thermus Aquaticus gewonnen, welches in Geysiren bei ca. 72°C lebt. Die taqPolymerase hat den entscheidenden Vorteil, dass sie bei den von der PCR benötigten 96°C ihre Funktion als Replikator beibehält. Der von der Polymerase neu synthetisierte komplementäre DNA- Strang ist in der Zeichnung orange dargestellt.

Mit diesem Schritt endet der erste Zyklus. Es sind bereits zwei DNA- Stränge des gesuchten Abschnittes vorhanden. Nun wiederholt man alle Schritte der Polymerase Kettenreaktion beginnend mit der Denaturierungsphase.

Diesmal binden sich die Primer an den originalen, aber auch an den neu synthetisierten Strängen und nach Vollendung des zweiten Zyklus sind dann schon acht gesuchte Stränge vorhanden. Nach ca. 40 durchgeführten Zyklen sind dann mehrere Milliarden Kopien des gesuchten Abschnittes vorhanden.

Die PCR läuft in einem so genannten Thermocycler ab. Dies ist ein Gerät, das automatisch je nach benötigter Temperatur das Reaktionsgefäß äußerst genau erhitzt oder auch abkühlt.

Weiters wird für eine fehlerfrei ablaufende Reaktion noch ein so genannter Mastermix benötigt. Dieser enthält Desoxynukleosidtriphosphate - kurz Nukleotide. Die Nukleotide sind die Grundbausteine der DNA und werden für das Synthetisieren der neuen Stränge benötigt.

Außerdem enthält er Puffersubstanzen (z.B.Cofaktoren für die Polymerase), die das optimale chemische Umfeld für die PCR gewähren.
Wasser und die Polymerase werden ebenfalls dem Mastermix beigemengt.

Das Problem bei unserem Test lag darin, dass das Erbmaterial der Viren, die wir untersuchten, nicht in Form von DNA, sondern als einzelsträngige RNA vorkam.

Da die Polymerase nur DNA vervielfältigen kann, mussten wir durch einen Zwischenschritt die einsträngige RNA in eine komplementäre doppelsträngige DNA (kurz cDNA) umcodieren.

Diese Aufgabe übernahm die Reverse Transkriptase. Dies ist ein Enzym ähnlich der Polymerase,die RNA als Vorlage für die Synthese von cDNA verwendet. Liegt die RNA dann in cDNA- Form vor, kann die Polymerase mit der Replikation des DNA- Stranges beginnen.

In unserem Fall wurde ein One-Step-Kit der Firma Qiagen verwendet. Dieser hatte die Besonderheit, dass er zusätzlich zu den zuvor erklärten Bestandteilen des Mastermix auch die Reverse Transkriptase enthielt und sowohl den Reverse Transkriptase-Vorgang als auch die Polymerase-Reaktion hintereinander in demselben Gefäß ausführt. Die Programmierung des Thermocyclers wurde dafür von uns entsprechend den Anforderungen angepasst.