In erster Linie war es wichtig, einen PCR-Primer zu finden, der nur beim Erbgut vom IAPV und nicht beim einheimischen APV, einem nahe verwandten Bienenvirus, hybridisiert (andockt.) Für das APV sind schon einige Tests entwickelt worden, jedoch zu diesem Zeitpunkt noch nicht für das IAPV.

Die gesuchten Primer hatten folgende Kriterien zu erfüllen:

Spezifizität auf das IAPV Genom

Paarweise gleiche Annealing-Temperaturen: Das ist jene Temperatur, bei der der Primer an die cDNA des Virus in der PCR hybridisiert.

Ähnlicher Cytosin- und Guanin- Anteil der Basensequenz: Dieser CG-Anteil bestimmt die Stabilität der Verbindung zwischen Primer und cDNA während der PCR.

Passende Länge: Wir wählten die kürzest mögliche Länge von ca. 20 bis 25 Basen, da der Preis der Primer von der Anzahl der Basen abhängt.

Die Primer wurden zu drei Abschnitten auf der RNA oder genau genommen cDNA des Virus designt. Diese Abschnitte stellen 3 spezifische Gene des IAPV dar, die beim APV anders sind.

Pro Genabschnitt wurden vom Primerdesign-Team, bestehend aus 3 SchülerInnen, jeweils 3 Primerpaare zusammengestellt. Jede Schülerin und jeder Schüler übernahm den Entwurf der Primer zu einer anderen IAPV-Gensequenz. Die benötigten cDNA-Sequenzen des IAPV recherchierten wir aus dem GenomeNet Database Service www.genome.jp.

Wir kopierten diese Genabschnitte des IAPV nun in ein Onlinetool zum Primerentwurf der Stanford Genomic Resources (http://seq.yeastgenome.org/cgi- bin/web-primer), welches uns nach langem und intensivem Probieren als Endprodukte die Sequenzen gewünschter Primerpaare lieferte.

Dieses Tool wurde ursprünglich für Hefe entwickelt und verwendet. Da jedoch der genetische Code aller Lebewesen gleich ist, kann man die Ergebnisse des Tools auch auf das gesuchte Virus anwenden.

Da die GenomeNet Database Service nicht beachtet, ob die Primerpaare ausschließlich bei den Basensequenzen des IAPV hybridisieren, mussten wir selbst sicherstellen, dass die Primer am Genom des einheimischen APV nicht andocken.

Dies erledigten wir, indem wir die gesamte Gensequenz des APV in ein Textverarbeitungsprogramm (MS Word und OO Writer) einfügten und über die „Suchen und Ersetzen“ Funktion kontrollierten, ob unsere Primerpaare in irgendeiner Weise beim APV andocken könnten.

Dazu gaben wir die Sequenzen der Primerpaare vorwärts, rückwärts und komplementär, ganz und gekürzt, in die Funktion ein und durchsuchten das APV-Genom danach. Schließlich blieb uns je ein Favorit pro verwendetem Genabschnitt übrig.

Diese Ergebnisse lauteten wie folgt:

Forward-Primer
CTGGCGATTCACAACAAGAA
Reverse-Primer
AAGCACCGTTGATGGTAATG

Forward-Primer - AATGCAAGTGAACGCTCCAA
Reverse-Primer - CCAATCATCTCCGTTTGCTA

Forward-Primer - GGTGTCCATTGGAACGAATGT
Reverse-Primer - CAAGGGTTTCAAATGCTTTAGC

Die Primer wurden von unserem Team über eine PCR mit Positivproben und zusätzlich in Zusammenarbeit mit Dr. Nowotny von der Universität Wien erfolgreich getestet.