Isolierung der viralen RNA

Als Ausgangsmaterial für den Nachweis von viralem Erbmaterial diente das in DEPC – Wasser gelöste Bienenhomogenat („Bienenschlunz“) vom vorhergehenden Labortag. Zuerst wurde das Homogenat kurz zentrifugiert, um unlösliches Material (Beine, Chitinpanzer, Flügel,…) loszuwerden. Für unsere Analyse verwendeten wir nur 140 µl der „klaren“ Flüssigkeit.

Als erstes mussten wir die Viren-RNA isolieren, um sie später in cDNA (complementary DNA) umzuwandeln, da die für die PCR verwendete Polymerase nur mit DNA als Vorlage arbeiten kann. Zum Isolieren verwendeten wir den QIAamp Viral RNA Mini Kit. Dieser enthält ein spezielles Eppendorfgefäß mit einem Filter (Säule), der die RNA festhält und den „Abfall“ wie Proteine, DNA, Fette etc. durchlässt.

Zuerst gaben wir einen Lysispuffer (AVL ) hinzu, der die Zellen aufbricht, um an die RNA zu gelangen. Die RNA wurde an die Säule gebunden und nach einigen Waschschritten konnte sie sauber isoliert werden.

Arbeitsablauf:

1. 560 µl AVL Puffer mit 140 µl Bienenhomogenat mischen

2. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
Bei diesem Schritt wurden die Zellen aufgebrochen und die RNA freigesetzt.

3. Zugabe von 560 µl Ethanol
Die Mischung mit Alkohol ist für eine effektive Bindung der RNA an die Säule nötig.

4. 630 µl der Mischung auf die Säule pipettieren und eine Minute bei 8000 rpm (Umdrehungen pro Minute) zentrifugieren

5. Die Säule in ein neues Sammelröhrchen stecken und die restliche Mischung auf diese pipettieren, erneut zentrifugieren
Die RNA ist nun an die Säule gebunden.

6. Zugabe von 500 µl AW1 (Wasch-) Puffer, eine Minute bei 8000 rpm zentrifugieren

7. Sammelröhrchen wechseln, Zugabe von 500 µl AW2 (Wasch-) Puffer, 3 Minuten bei 14000 rpm zentrifugieren
Durch beide Puffer wird die RNA sauber gewaschen.

8. Die Säule in ein sauberes Eppendorfröhrchen stecken und 60 µl Puffer AVE (Elutionspuffer) zugeben, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren

9. 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugieren

Der Elutionspuffer zerstört die Bindung zwischen Säule und RNA. Beim Zentrifugieren wird die RNA von der Säule heruntergelöst, die isolierte RNA wird bei -20°C gelagert.

Reverse Transkription und PCR

Für den Nachweis der Virus- RNA wurde der QIAGEN One Step RT-PCR Kit verwendet. In einer Reaktion wird zuerst die RNA in cDNA umgeschrieben (Reverse Transkription) und in einem zweiten Schritt die cDNA spezifisch vervielfältigt (PCR).

PCR Programm:

A)Reverse Transkription 30 min bei 50°C

B)PCR Aktivierungsschritt

15 min bei 95°C (bei diesem Schritt wird die Reverse Transkriptase inaktiviert und die DNA Polymerase aktiviert)

C)PCR 40x

Denaturierung 30 s, 95°C
Annealing 50s, 55°C (bei DWV und APV);
53°C bei IAPV
Extension 1min, 72°C
1x Final Extension 7min, 72°C

Geldokumentation:

Vorbereitung eines 1,2 % Agarose –Gels (1,2g Agarose auf 100 ml 0,5x TBE - Tris-Borat- Puffer): Die Agarose wurde in der Mikrowelle mit dem Puffer aufgekocht und zum Anfärben der DNA wurden 2 µl Gelstar (SYBR Green) zugegeben.
Nach dem Abkühlen wurde das Gel mit Laufpuffer übergossen und es konnten die Proben in die Gelkammern geladen werden. Das Gel wurde anschließen bei 150 Volt gefahren.

Probenvorbereitung:
Nach der abgeschlossenen RT-PCR wurden 5µl Ladepuffer zugegeben, um das Absinken der Probe beim Auftragen auf das Gel zu gewährleisten.