Klinik / Pathophysiologie

Die Entdeckung des Hämochromatose-Gens (HFE) durch Feder et al ermöglichte eine genetische Frühdiagnostik und das Screening von betroffenen Familien.

Das HFE Protein reguliert die Aufnahme von Eisen. Im HFE Gen wurden zwei Mutationen beschrieben. Mehr als 80 % der Patienten mit Hämochromatose weisen

Mit der Zentrifuge gehts dem Blut
an den Kragen

die homozygote Mutation C282Y auf. Patienten, die für die C282Y und die H63D Mutation heterozygot sind, haben ebenfalls ein erhöhtes Risiko eine Eisen-Stoffwechsel Störung zu entwickeln. Für die H63D-Mutation allein ist keine Assoziation mit Hämochromatose nachgewiesen.

Perfekt dokumeniert geht kein Ergebis verloren

Der Nachweis dieser Mutationen erfolgt mit Hilfe einer Multiplex-PCR der beiden betroffenen DNA-Abschnitte (Fragmentgröße 188 bp für den C282Y Locus und 130bp für den H63D Locus). Eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Bbr P I liegt jeweils im Bereich der beiden Mutationen. Ist durch Mutation auf einem Allel (heterozygot) diese Erkennungs-Sequenz verändert, so kommen jeweils zwei unterschiedlich große Fragmente zur Darstellung, während bei Personen mit zwei Wildtyp-Allelen jeweils nur ein Fragment auftritt. Da sich die dadurch entstehenden DNA-Fragmente in ihrer Größe ausreichend unterscheiden, ist eine elektrophoretische Auftrennung als Grundlage der Typisierung möglich.

Probe

2 ml EDTA-Blut vermengt mit dem Antigerinnungsmittel Heparin

Ist das wirklich nur mehr DNA im Röhrchen???

Primer

Primer 282 fwd: GTA CCC CCT GGG GAA GAG CAG AGA

Primer 282 rev: CCA TCC CCT AAC AAA GAG CAG TAC A

Primer 63 fwd: CAC AT CTC TGC ACT ACC TCT T

Primer 63 rev: GGC TCC ACA CGG CGA CTC ACG T

DNA-Extraktion mit QIAamp - Kit

QIAamp Säulchen in 2ml Sammelröhrchen (blau) stecken und 200 μl Blut auftragen, 1 min bei RT inkubieren

Zugabe von 400 μl DNA purification solution1. 1 min bei RT inkubieren

10 sec bei 12000g zentrifugieren, Sammelröhrchen mit Inhalt verwerfen

Säulchen in ein frisches Sammelröhrchen stecken und 400μl DNA purification solution1 dazu pipettieren. 1 min bei RT inkubieren

höchste Konzentrationsstufe

10 sec bei 12000g zentrifugieren,

200 μl DNA elution solution 2 zugeben, 10 sec bei 12000g zentrifugieren

Sammelröhrchen mit Inhalt verwerfen

Säulchen in ein frisches Röhrchen (weiß) stecken und 100μl DNA elution solution 2 zugeben.

10 min bei 99°C inkubieren und bei 12000g 20 sec zentrifugieren;

Eluat bis zur PCR bei 4°C lagern;

PCR- Beschreibung

Unter PCR- Polymerase Kettenreaktion versteht man ein Verfahren, bei dem ein ausgewählter Ausschnitt eines DNAStranges kopiert und somit vermehrt wird. Mittels Skizzen wird dieses Verfahren näher erklärt.

Die erste Skizze stellt einen DNA-Strang dar, aus dem ein bestimmter Bereich vervielfältigt werden soll. Dieser Bereich ist von den beiden orangen Linien begrenzt.

 

Damit dieser Abschnitt vermehrt werden kann, müssen zwei Stücke auf dem Strang bekannt sein. Diese sind jeweils am Anfang und am Ende des gesuchten Bereiches. Die Stücke sind meistens zwischen 18 bis 30 Nukleotide lang. Diese sind in der Grafik rot und blau dargestellt. Anhand der genauen Abfolge der beiden Stücke können nun komplementäre, sogenannte Primer erzeugt werden. Sobald diese vorhanden sind, kann die PCR starten.

 

Zuerst wird die noch doppelsträngige DNA auf 96°C erhitzt. Dieser Schritt wird als Denaturierungsphase bezeichnet und bewirkt ein Aufbrechen der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen, die die DNA-Stränge zusammenhalten, damit sie als einzelne Stränge vorliegen. Anhand der nächsten Skizze ist dieser Schritt gut erkennbar.

 

Im nächsten Schritt wird die Temperatur auf 50-65°C abgesenkt. Während der Primerhybridisierung (auch Primer-Annealing genannt) können die ausgewählten Primer an den richtigen Stellen anbinden. Bei welcher Temperatur die Primer jedoch am besten anbinden, ist von Primer zu Primer unterschiedlich, denn dies ist einerseits von der Länge der Primer, andererseits von der Anzahl der Basen Cytosin und Guanin abhängig. Denn zwischen diesen beiden Basen befinden sich immer drei Wasserstoffbrückenbindungen, so binden sich die Primer fester an den DNA-Strang. Deshalb wird eine höhere Schmelztemperatur benötigt. Je genauer diese gewählt wird, desto sicherer ist das Ergebnis. Bei ungenau eingestellter Temperatur binden sich die Primer gar nicht oder an falschen Stellen. Bei richtigem Ablauf kann man sich das Primer- Annealing wie in der Abbildung vorstellen.

 

Der dritte Schritt beginnt damit, dass die Temperatur auf 72°C erhöht wird. Somit schafft man der Polymerase perfekte Arbeitsbedingungen. Dieses Enzym setzt an den Primern an und ergänzt den einzelnen DNA-Strang komplementär, sodass er schlussendlich wieder doppelsträngig vorliegt. Hierzu verwendet man eine so genannte taqPolymerase. Diese hat den Vorteil, dass sie bei den erforderlichen 96°C nicht denaturiert und somit funktionsfähig bleibt. Der neu synthetisierte Strang ist im nächsten Bild grün dargestellt.

 

Somit ist der erste Zyklus beendet. Anschließend werden alle Schritte beginnend mit der Denaturierungsphase wiederholt. Nach 40 Zyklen sind mehrere Milliarden Kopien des gesuchten Abschnittes vorhanden.

Die gesamte PCR wird in einem Thermocycler durchgeführt. Es handelt sich hierbei um ein Gerät, das das Reaktionsgefäß sehr genau erhitzt, beziehungsweise abkühlt.

Für eine PCR wird noch der so genannte Mastermix benötigt. Dies ist ein Gemisch bestehend aus Desoxynukleosidtriphosphaten - kurz Nukleotiden, den Grundbausteinen der DNA, Puffersubstanzen und Hilfsstoffen für optimale chemische Bedingungen, Polymerase und Wasser. Der Mastermix wird der DNA beigemengt.

PCR- Amplifikation

ddH2O	36.5 μl
PCR buffer 10x	5 μl
dNTPs	1 μl	10 mM
Primer 1	1 μl	20 pmol/μl
Primer 2	1 μl	20 pmol/μl
Primer 3	1 μl	20 pmol/μl
Primer 4	1 μl	20 pmol/μl
Probe (DNA)	5 μl	>10ˆ6Kopien
Taq polymerase	0,5μl	5U/μl

ungeduldiges Warten auf Ergebnisse

PCR-Bedingungen:

initial 1 min 94°C, dann 35 Cyclen:

94 °C.......20 sec

55 °C.......20 sec

72 °C.......20 sec

in kleinen Mengen Richtung Ziel

Restriktion

ddH2O	8 μl
10x Puffer B	1 μl
RE (Bbr P I)	1 μl	(5 U/μl)
PCR Produkt	10 μl

1 Stunde bei 37°C inkubieren

Auftrennung der PCR-Fragmente (Agarosegel)

Agarosegel FMC 4 %;

Tris-Borat-Puffer pH 8,6;

Probenvorbereitung für die Elektrophorese

- 15 μl Probe (PCR-Verdau)

- 5 μl Probenpuffer

Proben auf den Boden der Geltaschen pipettieren;

Die Trennung dauert 2 Stunden bei 60 Volt;

Der MasterMixer kreiert den "PCR - Drink"

Ergebnis:

Beim homozygoten Wildtyp werden folgende Fragmente erzeugt: 162 bp C282Y und 110 bp H63D

Beim heterozygoten C282Y werden die Fragmente 188, 162 und 26 bp erzeugt

Beim Heterozygoten H63D werden die Fragmente 130, 110 und 20 bp erzeugt

Beim homozygot Mutierten: 188bp und 130bp

Unsere Ergenisse wurden durch das Zentrallabor des Landeskrankenhauses überprüft:

Probe	C282Y	H63D
1	wt	wt
2	wt	wt
3	wt	het
4	wt	het
5	wt	het
6	wt	wt
7	wt	mut
8	wt	wt
9	wt	wt
10	wt	wt
11	wt	het
12	wt	wt
13	wt	wt
14	wt	wt
15	wt	wt
16	wt	wt
17	wt	wt
18	het	wt

Wir präsentieren stolz unsere Ergebnisse

Die erste Probe ist uns leider ausgefallen, was wahrscheinlich an der fehlerhaften DNA-Isolierung lag. Bei Probe 5 passierte höchstwahrscheinlich ein Pipettierfehler. Bei Probe Nummer 18 war unsere Bande leider so schwach, dass auf dem Foto kein Unterschied zu den anderen Banden festgestellt werden konnte.

Kürzel – Erklärung:

wt: Wildtyp, nicht mutierte Gene

het: Heterozygot, Anlageträger

und Überträger, von zwei Allelen ist nur eines mutiert

mut: Homozygot, beide Allele sind mutiert,