1.Zellkultur
Wir bestellten unsere menschlichen Gehirnzellen mit Alzheimer-Charakteristika (SH-SY5Y) bei der Firma Sigma-Aldrich. Die Zellkulturarbeit fand in der Sterilbank statt, welche sterile
Arbeitsbedingungen schaffen und Kontaminationen vermeiden sollte. Um die Zellen zu passagieren (subkultivieren) wurden diese zunächst in den Kulturflaschen (75 cm2) mit dem speziellen
Puffer PBS gewaschen.
Der Puffer wurde dabei in die Kulturflasche pipettiert, vorsichtig über die Zellen verteilt und wieder abgesaugt. Die Zellen wurden sodann mithilfe von 1x Trypsin-EDTA in
PBS vom Boden der Kulturflasche abgelöst. Dazu wurden die Zellen mit besagter Lösung für ca. 90 sec bei 37°C inkubiert, die Ablösung der Zellen wurde durch vorsichtiges
Klopfen an die Flaschenwand gefördert.
Mit einer Pipette wurde die Lösung aufgenommen und die benötigte Menge davon wurde in eine neue Kulturflasche überführt, in die bereits 12 ml Medium
(10% DMEM und Ham’s F-12, im Verhältnis 1:1) vorgelegt worden waren.
Für das Zellsetup wurden die Zellen nach der beschriebenen Ablösung in ein Reaktionsgefäß (15 ml) überführt, in das 2 ml Medium vorgelegt worden waren. Die
Zellsuspension wurde bei 400 g für ca. 5 min zentrifugiert. Überschüssiges Medium bzw. überschüssige Trypsin-EDTA-Lösung wurde vom entstandenen Pellet entfernt.
Dieses Pellet wurde anschließend vollständig in frischem Medium gelöst. Danach wurden 10 µl der Zellsuspension entnommen und in eine Zählkammer pipettiert.
Die Zellzahl pro ml Zellsuspension wurde errechnet.
2. Transfektion
Für jeden Transfektionsansatz wurden je 100.000 Zellen in einem Volumen von je insgesamt 2 ml in einem Well einer 12-Well-Kulturschale angesetzt. Es wurden 37,5 ng der miRNA-107 mimic
in Medium (0% FBS) gelöst und mit 3 µl HiPerFekt Transfection Reagent (Qiagen) versetzt. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden pro Well 100 µl davon
zugegeben. Die Transfektion lief über 24 bzw. 72 Stunden. Nach Ablauf dieser Zeit erfolgte die Isolation der RNA gemäß nachfolgendem Protokoll.
3. RNA-Isolation
Die RNA-Isolation wurde bei Kontrollzellen (nicht-transfizierten Zellen) und transfizierten Zellen durchgeführt. Sie erfolgte mit den Reagenzien und Anleitungen des iScript RT-qPCR
Sample Preparation Reagent Kit der Firma Bio-Rad. Beide Ansätze waren im Vorfeld in Kulturschälchen vorbereitet worden. Am Tag der RNA-Isolation wurde das Medium im Überstand
abgenommen und die Zellen wurden mit PBS-Puffer gewaschen. Der Puffer wurde abgenommen und 100 µl iScript RT-qPCR Sample Preparation Reagent zugegeben. Die Schälchen wurden
geschwenkt, um für gleichmäßige Verteilung zu sorgen, und dann für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Lösungen aus den
Schälchen abgehoben und in Reaktionsgefäße überführt. Diese wurden auf Eis bzw. bei –20°C aufbewahrt, bevor zum nächsten Schritt, der reversen
Transkription, übergegangen wurde.
4. Die reverse Transkription
4.1. Einleitung
Man geht heute davon aus, dass die RNA eines der ersten biologisch aktiven Moleküle war. Erst im weiteren Verlauf der Evolution entwickelte sich die DNA. Chemisch gesehen ist die
RNA viel instabiler und reaktiver als die DNA, wodurch sich die DNA zur Langzeitspeicherform von Information durchsetzte. Es war für Lebewesen vorteilhaft, eine stabile Speicherform
für Information abgegrenzt in einem Zellkern zu haben und diese Information über den Weg der Umschreibung in mRNA (messenger RNA) weiterzugeben. Dieses „Zentrale Dogma der
Molekularbiologie“ ist schon lange Zeit bekannt: DNA wird im Vorgang der Transkription in mRNA umgeschrieben, welche dann im Vorgang der Translation in ein Protein übersetzt
wird. Mithilfe der mRNA hat man nun auch außerhalb des Zellkerns Kopien der Erbinformation, die zum „Bauen“ von Proteinen verwendet werden. Also kurz gesagt, die
Umschreibung von DNA auf RNA ist möglich. Jedoch war lange Zeit unbekannt, dass dieser Vorgang auch umgekehrt möglich ist, dass also ausgehend von einer RNA-Vorlage DNA
synthetisiert werden kann. In der Natur bedient man sich dieses Prinzips schon lange. So besitzen etwa bestimmte Viren ein Enzym, die so genannte „reverse Transkriptase“,
welche RNA in DNA umschreiben kann. Hier ist die Rede von Retroviren, welche der Gruppe VI in der Klassifikation nach Baltimore zuzuordnen sind.
In unserem Versuch isolierten wir zuerst die mRNA von Genen, welche uns interessierten, und schrieben sie mithilfe der reversen Transkriptase in cDNA (copy DNA) um. Im ersten Teil des
Prozesses liegt die vorerst einzelsträngige cDNA gebunden an die RNA vor, welche dann vom Enzym RNAse H abgebaut wird. Nach diesem Abbau bleibt lediglich der cDNA-Einzelstrang
übrig. Über DNA-Polymerase-Aktivität wird der fehlende Strang ergänzt, sodass am Ende des Prozesses doppelsträngige cDNA vorliegt.
4.2. Reverse Transkription ausgehend von mRNA
Die Schülerinnen und Schüler arbeiteten im Labor in drei Gruppen. Jede Gruppe hatte den Auftrag, mit RNA aus Kontrollzellen sowie mit RNA aus transfizierten
Zellen zu arbeiten.
Wir arbeiteten bei der Herstellung von cDNA aus mRNA mit dem iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (Qiagen). Zunächst wurden der iScript Reverse Transcription Mix und das
jeweilige RNA-Template auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden 12 µl nukleasefreies Wasser, 6 µl 5x iScript Reverse Transcription Supermix und 2 µl RNA-Template in ein
Reaktionsgefäß (0,5 ml) pipettiert und gut vermischt. Das Wasser ist frei von Nukleasen, da diese das RNA-Template zerstören würden. Nun begann die RT-Reaktion im
Thermocycler (Bio-Rad). Unser Programm startete mit dem „Priming“ über 5 Minuten bei 25 °C, dann kam es 30 Minuten lang zur reversen Transkription bei 42°C. In
diesem Schritt wird die cDNA gebildet. Anschließend erfolgte noch eine Temperatursteigerung auf 85°C für 5 Minuten, um die reverse Transkriptase zu inaktivieren. Nach
Ablauf des Programms wurden die Proben entnommen und bis zum nächsten Schritt bei –20°C aufbewahrt. Unser Ziel bei diesem Protokoll war es, cDNA zu gewinnen, um bei der
folgenden qPCR unsere Zielgene APP und BACE1 und unser Referenzgen Beta-Aktin (ACT) zu messen. Das Gen für ACT ist dabei unser „Housekeeping Gene“. Es ist in jeder Zelle
vorhanden und dient deshalb als Nachweis, ob überhaupt cDNA vorhanden war, sowie in Folge als Referenz bei der Quantifizierung. APP interessiert uns, da es ein so genanntes Vorläuferprotein
ist, welches von BACE1 geschnitten wird. Diese Reaktion ist grundlegend für die Bildung der Plaques.
4.3. Reverse Transkription ausgehend von miRNA
Die reverse Transkriptase schreibt wie schon erwähnt mRNA in cDNA um. Hier handelt es sich nun allerdings um miRNA. Der Unterschied zur vorher beschriebenen RT-Reaktion ist, dass miRNA im
Vergleich zu mRNA sehr kurz ist. Um für die folgende qPCR brauchbare Proben zu bekommen, befinden sich im miScript II RT Kit von Qiagen eine Poly-A-Polymerase und Oligo-dT-Primer. Die
Poly-A-Polymerase verlängert die miRNA um einen Adenin-Schwanz, somit kann der Oligo-dT-Primer daran ansetzen und als Startpunkt für die reverse Transkription dienen.
Zu Beginn wurde der Mastermix vorbereitet. Es wurden 8 µl 5x miScript HiSpec Buffer, 4µl RNase-freies Wasser, 4 µl 10x Nucleics Mix und 4 µl miScript Reverse Transcriptase
Mix in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Von diesem Mix kamen nun je 10 µl in ein Reaktionsgefäß (0,5 ml), welches anschließend mit 10 µl RNA-Template
(aus Kontrollzellen bzw. transfizierten Zellen) versetzt wurde. Die RT-Reaktion startete im Thermocycler von Bio-Rad. Unser hier verwendetes Programm begann mit 60 Minuten bei 37°C und
die Temperatur stieg dann für 5 Minuten auf 95°C. Nach Ablauf des Programms wurde die cDNA bis zum nächsten Schritt bei –20°C aufbewahrt.
5. qRT-PCR für Zielgene
5.1. Grundlagen der PCR
Die PCR („Polymerase Chain Reaction“) gehört zu den wichtigsten Methoden der Molekularbiologie. Mit dieser Methode hat man die Möglichkeit, aus einer geringen
Menge DNA innerhalb kurzer Zeit einen bestimmten DNA-Abschnitt zu vervielfältigen. Die PCR läuft in drei Schritten ab. Im ersten Schritt muss der DNA-Doppelstrang in die beiden
Einzelstränge aufgetrennt werden. Um dies zu erreichen, setzt man die DNA hohen Temperaturen aus (ca. 95°C). Dieser Vorgang wird „Denaturierung“ genannt. Danach folgt der
zweite Schritt, das „Annealing“. Bei diesem Schritt binden die Primer an die einzelsträngige DNA. Dabei handelt es sich um kurze DNA-Fragmente, die als Ansatzpunkt für
die DNA-Polymerase dienen.
Für eine erfolgreiche PCR braucht man ein Primerpaar, bestehend aus „forward Primer“ und „reverse Primer“, welche spezifisch an einen DNA-Abschnitt bzw. an ein
bestimmtes Gen binden. Man kann so die DNA zwischen den beiden Primern gezielt vervielfältigen (siehe Abbildung 1). Beim letzten Schritt, der „Elongation“, synthetisiert die
DNA-Polymerase ausgehend von den Primern den neuen DNA-Strang. Diese drei Schritte bilden einen PCR-Zyklus (siehe Abbildung 2). Nach Ablauf eines derartigen Zyklus beginnt der Prozess von
vorne mit der „Denaturierung“. Bei den meisten PCR-Reaktionen werden in Summe etwa 40 Zyklen durchgeführt, was einer Vervielfältigung der DNA um das 240- bzw. 1012-fache
entspricht. Für die PCR benötigt man eine kleine Menge DNA, hitzebeständige DNA-Polymerase, DNA-Nukleotide, den Kofaktor Magnesium und Primer.
Die PCR wird durchgeführt, um das Vorhandensein und damit die eventuelle Aktivität bestimmter Gene, der Zielgene, zu untersuchen. Spezifische Primer binden an die Zielgene und
erlauben nur deren Vervielfältigung. Bei der nachfolgenden Detektion gilt folgender Grundsatz: Je mehr Ausgangsmaterial eines bestimmten Gens vorhanden ist, umso weniger
Vervielfältigungsschritte bzw. Zyklen sind nötig.
Abbildung 1: Primer sind kurze DNA-Fragmente, die eine DNA-Sequenz an einzelsträngiger DNA erkennen und dort binden. Mit Hilfe von Primern kann man bestimmen, welche
DNA-Fragmente man vervielfältigen möchte. Dazu benötigt man zwei Primer, einen für jeden DNA-Strang. In der Grafik wird so mit den beiden Primern das graue DNA-Fragment vervielfältigt.
Grafik von Michael Gadermaier, 2011
Abbildung 2: Schematischer Ablauf einer PCR. Im ersten Schritt, der „Denaturierung“, wird die doppelsträngige DNA in die beiden Einzelstänge auftrennt.
Beim „Annealing“ binden die Primer an die einzelsträngige DNA. Der letzte Schritt ist die „Elongation“; hierbei verlängert die DNA-Polymerase die Primer.
Anschließend folgen weitere Zyklen.
RealTime PCR Applications Guide, Bio-Rad (2006)
5.2. qRT-PCR
Die quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) ist eine Methode, die auf der klassischen PCR basiert. Für die Detektion von doppelsträngiger DNA kann ein Farbstoff wie SYBR Green verwendet werden,
der die Eigenschaft hat, sich in den DNA-Doppelstrang einzulagern und dann ein Lichtsignal abzugeben. Der verwendete Farbstoff SYBR Green zeigt nur dann Fluoreszenz, wenn er sich in doppelsträngige
DNA einlagern kann. Wenn hingegen nur einzelsträngige DNA vorhanden ist, zeigt der Farbstoff kein Fluoreszenzsignal. Dieses Fluoreszenzsignal kann in weiterer Folge für die Bestimmung der
relativen Menge der Zielgene herangezogen werden (siehe Abbildung 3). Bei der Auswertung gilt folgendes Prinzip: Je weniger PCR-Zyklen nötig sind, um ein entsprechendes Fluoreszenzsignal zu
erreichen, desto mehr Zielgen ist vorhanden und es kann daher auf eine entsprechend höhere Aktivität dieses Zielgens rückgeschlossen werden.
Abbildung 3: Die Grafik zeigt, wie der Farbstoff SYBR Green sich in die doppelsträngige DNA einlagert und damit ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Dies geschieht während der
PCR-Reaktion. Bei der „Denaturierung“ ist kein Signal messbar, da sich die doppelsträngige DNA in die Einzelstränge getrennt hat. Beim „Annealing“ kann sich SYBR
Green schon in den gerade synthetisierten DNA-Doppelstrang einlagern. Am Ende der „Elongation“ ist die DNA mit SYBR Green gesättigt und zeigt die maximale Fluoreszenz; bei diesem
Schritt wird auch die Fluoreszenz im Rahmen der qPCR gemessen.
RealTime PCR Applications Guide, Bio-Rad (2006)
5.3. Protokoll
Für die qRT-PCR verwendeten wir den qRT-PCR Sso SYBR Green Supermix von Bio-Rad. In diesem Reaktionspuffer sind alle wichtigen Bestandteile für die qPCR enthalten, d. h. die DNA-Polymerase,
DNA-Nukleotide sowie der Kofaktor Magnesium. Die für die Reaktion nötigen Primer zur Vervielfältigung der Gene BACE1, APP und ACT wurden von der Firma Eurofins hergestellt. Zu 5 µl
von besagtem Supermix wurden 2,5 µl nukleasefreies Wasser und 2 µl cDNA zugegeben. Sodann kamen noch je 0,25 µl forward und reverse Primer hinzu. Damit war die Probe fertig für
die qPCR. Für die Durchführung der qPCR verwendeten wir das Gerät CFX96 Real-Time PCR Detection System von Bio-Rad.
Am Anfang der qPCR stand ein Aktivierungsschritt, der für die Aktivität der DNA-Polymerase essenziell ist. Die nächsten Schritte wurden dann 40 Mal wiederholt, wobei sich bei jeder
Wiederholung des Zyklus die Menge an DNA verdoppelte. Bei der qPCR ist es am Anfang generell wichtig, die gesamte DNA zu denaturieren, also die doppelsträngige DNA in ihre Einzelstränge zu
trennen. Dazu wurden die Proben für 5 Sekunden auf 95°C erhitzt und dann für 40 Sekunden auf 60°C abgekühlt. Bei dieser Temperatur konnten unsere Primer an die DNA binden und die
Arbeit der Polymerase konnte beginnen. Anschließend folgte ein neuer Zyklus und damit wieder ein Denaturierungsschritt. Am Ende der 40 Zyklen wurde zur Kontrolle eine Schmelzkurve gestartet:
Dabei wurde die DNA in Schritten von 0,5°C, die jeweils 2 Sekunden dauerten, von 65°C auf 95°C erhitzt. Hierbei kann man erkennen, ob die qPCR funktioniert hat. Die einzelnen Schritte
der qPCR sind nachfolgend in Tabelle 1 dargestellt.
| Schritte | Temperatur | Zeit | Zyklen |
| Aktivierung | 95°C | 30 sec | 1 |
| Denaturierung | 95°C | 5 sec | 35 bis 40 |
| Elongation | 60°C | 40 sec | 35 bis 40 |
| Schmelzkurve | 65°C bis 95°C (in Schritten à 0,5°C) | 2 bis 5 sec pro Schritt | 1 |
Tabelle 1: Übersicht über die Schritte der qRT-PCR für Zielgene
5.4. Proben
Für unsere Untersuchungen legten wir eine Alzheimer-Zellkultur an, welche in zwei Teile aufgeteilt wurde. Eine der Kulturen wurde nicht behandelt und diente als Kontrolle, die andere wurde mit miRNA
transfiziert. Das bedeutet, dass wir miRNA-107 mimic in die Zellen eingeschleust haben. Aus beiden Zellkulturen wurde die vorhandene mRNA gewonnen. Dieser RNA-Typ ist für die Bildung von Proteinen
wichtig. In einer RT-Reaktion wurde die gesamte in der Zelle vorhandene mRNA in cDNA umgeschrieben, da wir diese für die qPCR benötigen. In der qPCR wurde mit spezifischen Primer-Paaren (Eurofins)
gearbeitet. Jedes Zielgen benötigt ein eigenes Primerpaar. Die von uns untersuchten Gene bzw. die daraus gebildeten mRNAs waren ACT („Housekeeping Gene“ als Referenzgen), APP und BACE1.
Aus dem Vergleich der Gehalte an mRNA der Zielgene der Kontrollzellen und der transfizierten Zellen konnten wir dann schließen, wie die miRNA-107 auf diese mRNAs bzw. auf die Expression der
betreffenden Gene wirkt.
6. qRT-PCR für miRNAs
6.1. Grundlage qRT-PCR für miRNAs
Die quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) für miRNAs beruht auf denselben Grundlagen wie die qRT-PCR für Zielgene (siehe 5.). Um diese kleinen RNA-Moleküle detektieren zu können,
muss bereits bei der RT-Reaktion, bei der unsere cDNA entsteht, die cDNA mit einem so genannten PolyA-Schwanz am 3’-Ende der miRNA verlängert werden, um eine „Andockstelle“
für den Oligo-dT-Primer zu schaffen (siehe 3.).
Ausgehend von dieser cDNA erfolgte beim ersten PCR-Zyklus das Andocken eines spezifischen miRNA-Primers, der nur eine, in unserem Fall die humane miRNA-107, erkennt, und so die Vervielfältigung
anderer miRNAs ausschließt. Bei den folgenden PCR-Zyklen wurde also nur mehr diese miRNA-107 detektiert und quantifiziert. Um auch den Gegenstrang synthetisieren zu können, wurde nach dem
ersten PCR-Zyklus zusätzlich noch ein miRNA-Universal Primer (1), der potenziell an alle miRNAs binden kann (siehe Abbildung 4), zugegeben. Durch die Selektion mit dem spezifischen miRNA-Primer
im ersten Schritt konnte dieser anschließend verwendet werden (2).
Abbildung 4: qRT-PCR mit miScript SYBR Green PCR Kit und miScript Primer Assay von Qiagen (3).
Nach der Selektion der miRNA-107 im ersten Schritt wurden die PCR-Zyklen unter Zuhilfenahme eines „Universal Primer“ durchgeführt.
Im vorliegenden Fall verglichen wir die miRNA-107-Levels der Kontrollzellen mit den miRNA-107-Levels der transfizierten Zellen. Laut einer Veröffentlichung von Wang und Kollegen aus dem Jahr 2008 ist das
miRNA-107-Level schon im frühen Alzheimerstadium erniedrigt (4). Unsere Annahme war daher, dass in den Alzheimermodell-Kontrollzellen die miRNA-107-Levels gering sind und diese durch die Transfektion
erhöht werden können, was wiederum eine Auswirkung auf die Expression der Zielgene der miRNA-107 haben sollte (siehe 5.).
6.2. Protokoll qRT-PCR für miRNAs
Die mit dem miScript II RT Kit (Qiagen) produzierte cDNA der Kontrollzellen und der transfizierten Zellen (je 3 Gruppen von Schülerinnen und Schülern) wurde für die qRT-PCR für miRNAs
verwendet. Für die qRT-PCR wurden der miScript SYBR Green PCR Kit und der miScript Primer Assay für hsa-miRNA-107 (humane miRNA-107) von Qiagen benutzt. Der miScript SYBR® Green PCR Kit
beinhaltet QuantiTect SYBR® Green PCR Master Mix und miScript Universal Primer (1). Zusätzlich wurde noch der spezielle Primer für die humane miRNA-107 (miScript Primer Assay für
hsa-miR107, Qiagen (5)) benötigt. Die Reagenzien der Kits und die cDNA wurden auf Eis aufgetaut. Die einzelnen Proben wurden in Tripletts gemäß den Angaben von Tabelle 2 in
PCR-Reaktionsgefäße (Bio-Rad (6)) pipettiert (je 3 cDNAs aus Kontrollzellen und 3 cDNAs aus transfizierten Zellen).
| 1 Ansatz µl | 3 Ansätze µl | |
| SYBR Green PCR Mastermix | 5.00 | 15.0 |
| cDNA template (cDNA: 100ng-100fg) | 1.00 | 3.0 |
| Gesamt | 6.00 | 18.0 |
| Nuclease-free water | 2.00 | 6.0 |
| 10x miScript Universal Primer | 1.00 | 3.0 |
| 10x miScript Primer | 1.00 | 3.0 |
| Gesamt | 4.00 | 12.0 |
| Summe | 10 |
Tabelle 2: Reaktionsansatz für qRT-PCR für miRNA-107, optimiert nach (7)
Die qRT-PCR wurde im CFX96 Real-Time PCR Detection System von Bio-Rad (8) gemäß den Angaben in Tabelle 3 (9) durchgeführt.
| Schritte | Temperatur | Zeit | Zyklen |
| Aktivierungsschritt | 95°C | 15 min | 1 |
| Denaturierung | 94°C | 15 sec | 35 bis 40 |
| Annealing | 55°C | 30 sec | 35 bis 40 |
| Elongation | 70°C | 30 sec | 35 bis 40 |
| Schmelzkurve | 65°C bis 95°C (in Schritten à 0,5°C) | 2 bis 5 sec pro Schritt | 1 |
Tabelle 3: Übersicht über die Schritte der qRT-PCR für miRNA-107 (9)
6.3. Quellen
(1) Qiagen miScript SYBR® Green PCR Kit Product Details, http://www.qiagen.com/products/miscriptsybrgreenpcrkit.aspx(2.2.12)(external link)
(2) Qiagen miScript II RT Kit Product Details, http://www.qiagen.com/products/miscriptiirtkit.aspx#Tabs=t1(external link)
(3) Qiagen miScript II RT Kit Product Details, http://www.qiagen.com/products/miscriptiirtkit.aspx#Tabs=t1(external link) Figure: Selective conversion of mature miRNAs into cDNA in miScript HiSpec Buffer
(4) Wang, W. X., B. W. Rajeev, et al. (2008). "The expression of microRNA miR-107 decreases early in Alzheimer's disease and may accelerate disease progression through
regulation of beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1." J Neurosci 28(5): 1213-1223.
(5) Qiagen miScript Primer Assays (Hs_miR-107_2 miScript Primer Assay (100), MS00031255), http://www.qiagen.com/products/miscriptprimerassays.aspx#Tabs=t1
(6) PCR Strips Bio-Rad Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips without Caps #TLS-0801+ Optical Flat 8-Cap Strips #TCS-0803
(7) Qiagen miScript SYBR® Green PCR Kit Resources, Qiagen miScript SYBR® Green PCR Kit used with miScript Primer Assays or miScript Precursor Assays Quick-StartProtocol,
Seite 3, http://www.qiagen.com/products/miscriptsybrgreenpcrkit.aspx#Tabs=t2(external link)
(8) CFX96 Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad
(9) Qiagen miScript SYBR® Green PCR Kit, Resources, Qiagen miScript SYBR® Green PCR Kit used with miScript Primer Assays or miScript Precursor Assays
Quick-StartProtocol, Seite 4, http://www.qiagen.com/products/miscriptsybrgreenpcrkit.aspx#Tabs=t2(external link)