Für das untersuchte Gen TAS2R38 sind drei Punktmutationen (SNPs) möglich, die für die Funktion des Geschmacksrezeptors entscheidend sind. Um diese Punktmutationen identifizieren zu können, mussten wir für jede ein Set aus zwei DNA-Sonden besorgen. Eine der Sonden kann an die DNA binden, wenn keine Mutation vorliegt (Wildtyp) und die andere, wenn eine Mutation (Mutante) an dieser Stelle vorhanden ist. Jede der beiden Sonden ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert, in unserem Fall waren das die Farbstoffe FAM und HEX. Über diesen Farbstoff können wir feststellen, welche Sonde an unsere Versuchs-DNA bindet. Außer diesem Farbstoff tragen die Sonden noch einen sogenannten Quencher. Der Quencher unterdrückt die Fluoreszenz des Farbstoffes, so lange sich dieser auf der DNA-Sonde befindet. Wird jedoch der Farbstoff von der Sonde abgespalten, kann der Quencher die Fluoreszenz nicht mehr unterdrücken und es kommt zu einer – für uns messbaren – Fluoreszenz.

Die Abspaltung des Farbstoffes wird durch die PCR verursacht (PCR = Polymerase Chain Reaction, eine Technik um DNA zu vermehren). Passieren kann dies aber nur, wenn die DNA-Sonde komplett an die Zielsequenz (= unser Bereich der jeweiligen Punktmutation) binden kann. Generell werden bei der PCR DNA-Fragmente vermehrt. Die Größe und Position wird durch sogenannte Primer genau festgelegt. Eine PCR benötigt dafür zwei Primer, die den gewünschten DNA-Abschnitt flankieren, in unserem Fall jenen Abschnitt, der die Mutation tragen kann. Nur dieser DNA-Abschnitt wird bei der PCR vermehrt. Die Vermehrung geschieht exponentiell, d. h. dass bei jedem PCR-Zyklus die vorhandene Menge des DNA-Abschnitts verdoppelt wird (nach 50 Zyklen haben wir 250 = ca. 1015 Mal soviel DNA wie zu Beginn). Die Bildung der neuen DNA-Stränge passiert durch die DNA-Polymerase. Die DNA-Polymerase hat bei unserem System noch eine weitere Aufgabe: Sie sorgt auch für die Abspaltung unseres Fluoreszenz-Farbstoffes von der Sonde (Abb. 1). Aber nur die Sonden, die auch 100%ig an die DNA binden können, verlieren ihren Farbstoff. Wenn nun der Farbstoff von der DNA abgespalten wurde, wird die Fluoreszenz nicht mehr vom Quencher, welcher noch an der Sonde hängt, unterdrückt und wir können diese messen. Bei der von uns verwendeten qPCR haben wir die Möglichkeit, die entstandene Fluoreszenz nach jedem PCR-Zyklus zu messen. Anhand der entstehenden Kurven (Beispiel Abb. 2) können wir feststellen, ob die Wildtypvariante oder die Mutante vorhanden ist.

Je nachdem, ob jetzt der Farbstoff, der die Wildtyp-Sequenz markiert, der Farbstoff der Mutanten-Sonde oder sogar beide Farbstoffe messbar sind, können wir feststellen, welcher Genotyp vorhanden ist. Wenn nur ein Farbstoff feststellbar ist, handelt es sich um einen homozygoten Genotyp, das bedeutet, dass beide Chromosomen die gleiche Genvariante tragen. Dies kann entweder der nicht mutierte Wildtyp oder die Mutante sein. Wenn wir beide Farbstoffe messen können, ist auf einem Chromosom das Wildtyp-Gen vorhanden und auf dem anderen die Mutante. Wir können aber nicht feststellen, auf welchem Chromosom welche Variante vorhanden ist. Für eine bessere Auswertung und Darstellbarkeit der Ergebnisse empfiehlt es sich, die Fluoreszenzwerte der einzelnen Farbstoffe in ein Koordinatensystem aufzutragen (Abb. 3). In der Grafik kann man drei Gruppen von Messwerten erkennen. Die Quadrate ganz links stehen für die DNAs, die homozygot beim Wildtyp sind. Die Kreise ganz rechts kennzeichnen die DNAs, die homozygot die Mutation zeigen. Die größte Gruppe der Dreiecke, in der Mitte der Grafik, kennzeichnet die Versuchs-DNAs, die heterozygot sind, also wo ein Chromosom die Punktmutation trägt und das andere nicht.

Heterozygote und homozygote Proben kann man einfach an den Fluoreszenzintensitäts-Kurven der beiden verwendeten Farbstoffe erkennen. Es zeigen sich markante Unterschiede zwischen homozyogt Wildtyp, heterozygot und homozygot Mutante (Abb. 4). Bei homozygoten Proben zeigt nur einer der beiden Farbstoffe einen markanten Fluoreszenzanstieg (Abb. 5), während der andere Farbstoff keinen nennenswerten Anstieg der Fluoreszenz zeigt. Ob es sich um einen homozygoten Wildtyp oder um eine homozygote Mutante handelt kann man bestimmen indem man feststellt, welcher Farbstoff den Fluoreszenzanstieg zeigt und welcher nicht. Bei einem heterozygoten Genotyp zeigen beide Farbstoffe einen starken Anstieg der Fluoreszenz, der in etwa gleich stark ist (Abb. 6). Hier sind also sowohl das Wildtyp als auch das Mutanten Gen vorhanden.

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