Wir starteten mit der Laborarbeit am 2.12.2010 um 8 Uhr. Unser Laborleiter Michael Gadermaier führte uns mit einer Präsentation in die Grundlagen der Laborarbeit ein. Unser Ziel war es, festzustellen, ob bestimmte Punktmutationen im Gen TAS2R38 mit der unterschiedlichen Geschmackswahrnehmung unserer ProbandInnen in Bezug auf Bitterstoffe korrelierten. Dazu untersuchten wir auf der DNA drei Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs), d.h. Veränderungen von einzelnen Basen in der DNA. Für jede mögliche Mutationsstelle mussten wir das Vorhandensein der Mutation einzeln untersuchen. Dies geschah mit Hilfe der Real-Time-PCR-Maschine (qPCR), wo die einzelnen untersuchten DNA-Stränge vermehrt wurden. Dabei misst die Maschine das Leuchten der einzelnen Proben, das von den davor zugegebenen Sonden ausgeht. Sonden sind DNA-Fragmente, die synthetisch kreiert werden und die komplementär zur untersuchten DNA-Sequenz sind. Die Sonde für den Wildtyp und die Sonde für die Mutante tragen verschiedene Farben. Je nachdem, welcher Farbstoff freigesetzt wird, kann man feststellen, welche Variante auf der untersuchten DNA vorhanden ist. Die qPCR sendet die gemessenen Daten an eine spezielle Computersoftware, wo sie ausgewertet werden und grafisch dargestellt werden können. Kann z.B. eine Mutanten-Sonde nicht andocken, so bekommt die Software von der qPCR die Information übermittelt, dass kein Leuchten des entsprechenden Farbstoffes festgestellt werden konnte. Die Software gibt dann aus, dass in dieser Probe keine Mutation vorhanden war. Nachdem sämtliche Fragen beantwortet waren gingen wir ins Labor, um das Gelernte praktisch umzusetzen.

Es wurden Gruppen mit jeweils drei Personen gebildet, jeder Gruppe wurden drei DNA-Proben zugeteilt. Wir begannen mit der Vorbereitung der Eppendorf-Röhrchen, liebevoll Eppis genannt. Für jede DNA-Probe wurden drei Eppis benötigt. Entsprechend unserem Anonymisierungskonzept erhielten die Proben einen vierstelligen Zahlencode, mit dem nun auch die Eppis versehen wurden. So würden die Ergebnisse der DNA-Analyse später bei der Auswertung dem Fragebogen zugeordnet werden können.

In das erste Eppi gaben wir 200 µl Lysispuffer und ein Wattestäbchen. Den nicht benötigten Plastikstiel des Stäbchens schnitten wir mit einer Schere ab, die davor in Ethanol getaucht und über dem Bunsenbrenner abgeflammt worden war und damit steril gemacht worden war. Der Lysispuffer bricht die Zellwand auf, wodurch DNA, Proteine und Ähnliches aus den Mundschleimhautzellen herausgelöst werden. Zur Unterstützung dieses Prozesses wurde das Eppendorf-Röhrchen fest verschlossen und in einen Heizblock gestellt, wo die Lösung bei 56°C für etwa 30 min. ständig geschüttelt wurde. Danach stellten wir die Röhrchen mit dem Deckel auf die Arbeitsfläche, und zwar deshalb, weil der Wattebausch aus der Spitze entfernt werden musste. Als nächstes stachen wir nämlich mit einer per Bunsenbrenner ausgeglühten Nadel in die Spitze des Eppendorf-Röhrchens. Nach jedem Durchlauf mussten wir die Nadel erneut ausglühen, um eine Kontamination durch eine 'falsche' DNA zu verhindern. Darauf steckten wir nun das zweite, leere Eppendorf-Röhrchen, welches durch den Zahlencode als zugehörig gekennzeichnet worden war. Diese beiden aufeinander gesteckten Röhrchen wurden gemeinsam einige Sekunden zentrifugiert, um so die Lösung in das leere Eppi zu „schleudern“. In dieser Lösung waren nun DNA, Proteine und einige weitere Zellorganellen gelöst. Um die unerwünschten Bestandteile aus der Lösung zu entfernen, wurden 100 µl Protein-Präzipationslösung zugegeben, die all jene Komponenten ausfällte, die bisher noch frei in der Lösung waren. Nachdem diese Probe nun für fünf Minuten eisgekühlt gelagert worden war, gaben wir sie mit der Deckelhalterung nach außen in die Zentrifuge. So wurden die ausgefällten Proteine an der Spitze zentriert. Nach dem Zentrifugieren sah man ein weißes Pellet, es handelte sich dabei um die ausgefällten Proteine. Nun war eine gezielte Trennung von der DNA möglich, indem man einfach die Lösung in das dritte freie Eppendorf-Röhrchen leerte und darauf achtete, dass das Pellet zurückblieb. Nachdem dieser Schritt erledigt war, wurden langsam 400 µl Iso-Propanol zugegeben. Dann wurde jede Probe zwanzigmal per Hand gekippt. Nachdem sie noch 2 min. bei Raumtemperatur zur Fällung im Labor gestanden hatte, wurde sie weitere 5 Min. zentrifugiert. Dies garantierte die Ausfällung der DNA. Der entstehende Überstand wurde wiederum abgeleert und zur Reinigung der DNA wurden noch 500 µl Ethanol dazu pipettiert. Diese Probe wurde erneut für 5 Min. zentrifugiert. Nach diesem Prozess ist meist kein Pellet mehr sichtbar und man muss bei diesem Schritt vorsichtig hantieren, um Erschütterungen zu vermeiden. Auch wenn das Pellet mit freiem Auge nicht erkennbar ist existiert es nämlich – und es handelt sich dabei um die benötigte DNA. Der Überstand wurde vorsichtig abgeleert, ein Rest des Überstandes musste noch vorsichtig abpipettiert werden. Dabei musste man unbedingt beachten, dass das Pellet im Eppendorf-Röhrchen blieb. Durch die Fliehkräfte in der Zentrifuge hatte sich die DNA im spitzen Ende des Eppis angesammelt, und zwar auf der Seite der Deckelhalterung. Das Pellet war also nicht direkt in der Spitze zu finden, sondern war an an den Rand gedrückt worden, weil das Eppi schräg in der Zentrifuge gestanden hatte. Da die Seite mit der Deckelhalterung nach außen zeigen sollte, ergab es sich, dass die DNA an diesen Rand versetzt war. Man musste mit der Pipettenspitze genau gegenüber ansetzen und extrem vorsichtig ansaugen, damit das Pellet nicht herausgesaugt und weggeleert wurde. Um zur wirklich reinen DNA zu gelangen, kam das Eppi nochmals für rund 15 Minuten bei 56°C auf den Heizblock, damit alles Überflüssige verdampfte.

Am Ende kamen noch 20 µl Hydration Solution hinein. Dadurch war die DNA in einer Lösung verfügbar, die keine eigenen, ergebnisverfälschenden Attribute hat. Dieses Mittel ist eigentlich nur ein professioneller Ersatz für destilliertes Wasser.

Die Probe wurde eingekühlt, falls die qPCR gerade nicht frei war. Danach mischte unser Laborleiter Michael die von uns abgefertigte, isolierte DNA mit einem Mastermix, bestehend aus Sonden, Polymerasen, Nucleotiden, Primern und Puffern. Die Mischung kam, in einer Folie verschweißt, in die Real-Time-PCR. Die Folie verhindert das Verdampfen der Probe bei den hohen Temperaturen in der qPCR Maschine. Nach 50 Zyklen, etwa 2 Stunden später, war die Real-Time-PCR Maschine fertig und hatte ihre Messungen an das Programm übermittelt. Damit waren die Rohdaten für uns übersichtlich aufbereitet und wir konnten die Ergebnisse weiterverarbeiten.